Este método puede revelar patrones espaciales de expresión génica bacteriana y estrategias para la adaptación fisiológica a los microambientes del tejido huésped que se pierden cuando se promedian en toda la población en los tejidos. Con esta técnica se pueden detectar heterogenidades potenciales que deben ser consideradas al identificar nuevas vías bacterianas y proteínas a ser objetivo de antivirulencia o compuestos antibacterianos. Comience por rayar cepas de S.aureus de interés en las placas de agar de sangre de una población de glicerol congelado e incubar las placas a 37 grados Celsius durante 16 a 24 horas para confirmar sus fenotipos hemolíticos basados en su capacidad para linsear glóbulos rojos y formar zonas transparentes claras.
Inocular aislados de colonia única de cada cepa en cuatro mililitros de caldo de soja tríptico, o TSB, en tubos de vidrio estériles y rotar los tubos a 37 grados Celsius durante 16 a 24 horas en un rodillo de tubo en un ángulo de aproximadamente 70 grados y 70 rotaciones por minuto. A la mañana siguiente medir la densidad óptica a 600 nanómetros, o OD 600, de los cultivos en un espectrofotómetro y diluir las células a un OD 600 de 0.05 en 25 mililitros de TSB estéril a una relación de entre dos y un volumen en matraces Delong de 125 mililitros. Incubar los cultivos en un baño de agua celsius de 37 grados a 280 rotaciones por minuto y cosechar las células durante la fase exponencial.
Pele el Plículo de las células por centrifugación y lavar las células dos veces en un volumen igual de PBS estéril. Luego resuspendir las células en PBS fresco a una por 10 a la octava colonia formando unidades por mililitro de concentración para su posterior inyección en un animal receptor. En el punto final experimental apropiado, cosecha el riñón, el corazón, el hígado, los pulmones y el bazo en tubos de polipropileno de 15 mililitros que contienen 10% de formalina tamponada durante una incubación de 24 a 48 horas en la oscuridad a temperatura ambiente con suave temblor o rotación.
Al final de la fijación, incruste los órganos en un medio de congelación de tejido transparente para almacenarlos a menos 80 grados centígrados. Utilice un criostato para adquirir secciones de tejido de 10 micrómetros de espesor y secar las secciones en diapositivas de vidrio cargadas pre-limpiadas individuales durante 20 minutos en la oscuridad antes de aplicar el medio de montaje duro complementado con DAPI. A continuación, aplique los resbalones de cubierta y cure los portaobjetos a temperatura ambiente durante la noche antes de transferir las muestras a un almacenamiento a largo plazo a cuatro grados centígrados.
Para identificar lesiones dentro de las muestras, coloque una diapositiva en el escenario de un microscopio confocal de escaneo láser y utilice un objetivo adecuado para visualizar células individuales para adquirir imágenes de las lesiones. Para medir las intensidades de fluorescencia dentro de las imágenes confocales, abra una imagen en ImageJ y ajuste el brillo y el contraste para visualizar correctamente la señal de fluorescencia de la lesión. Defina la región de interés mediante la herramienta de selección de polígonos y añada el ROI al gestor de ROI en la pestaña Editar de ImageJ.
Seleccione Editar, luego Selección y, finalmente, Agregar al administrador. A continuación, cambie el nombre del ROI y etiquete la imagen respectiva. Para definir el centroide, abra la pestaña Analizar y seleccione Area, Valor gris medio, Centroide y Límite a umbral.
Extraiga el valor de intensidad de fluorescencia centroide o mida la intensidad media de fluorescencia en una lesión dada por unidad de área. Esto se puede lograr utilizando la función de umbral para establecer los límites de fluorescencia inferior y superior según sea necesario. Exporte los datos a un archivo de Excel y prepare una columna que indique la intensidad media de fluorescencia por unidad de área para la periferia y el núcleo.
Para calcular las intensidades medias de fluorescencia por unidad de área en la periferia y el núcleo, defina manualmente los límites superior e inferior del umbral. La fluorescencia de fusión staphylococcus aureus thermonucleasa GFP es en promedio casi nueve veces mayor en las células que en las células que en las células que no llevan la fusión del reportero. Del mismo modo, la fluorescencia de fusión de tomate dimerico tándáctico es aproximadamente seis veces mayor que el control de reportero nulo.
El patrón de las actividades del reportero se puede confirmar mediante citometría de flujo con homogeneizatos tisulares. Aunque las diferencias de pliegue en la fluorescencia son típicamente más bajas. Las variaciones en las mediciones de fluorescencia pueden deberse a la expresión heterogénea de los reporteros.
Por ejemplo, en estas muestras representativas se observó que algunas lesiones expresan uno o ambos de los reporteros dentro de aproximadamente 100 micrómetros de distancia en la misma muestra de tejido. El examen de la actividad del reportero a una resolución de una sola célula en comunidades de abcesas estafilocócicas revela una regulación espacial de la expresión de estafilococo aureus thermonucleasa en abscesos circunscritos con una fuerte tinción DAPI, probablemente asociada con la formación y liberación de trampas extracelulares de neutrófilos. Por ejemplo, se observa una fluorescencia de fusión de la fluorescencia de la RFP estafilococo auresa significativamente mayor en el núcleo interior de la comunidad de abcesas estafilocócicas en comparación con la localización en la periferia.
En la misma abcesa, el patrón para la fluorescencia de fusión de tomate dimerico tándúrico parece invertirse. Sin embargo, el patrón de este experimento no fue estadísticamente significativo. La obtención de disecciones crio-integradas intactas es vital para el análisis de la imagen de fluorescencia y debe hacerse cuidadosamente.
La clasificación de las células bacterianas para capturar submociones que expresan la fusión en diferentes medidas, junto con el análisis de ARN-Seq podría iluminar los cambios anchos del genoma en el transcriptoma. Tenga cuidado al trabajar con formalina, ya que es un carcinógeno y puede causar irritación de la piel, reacciones alérgicas o daño ocular tras la exposición directa. Generar derivados mutantes de cepas que llevan reporteros fluorescentes de interés puede ayudar a revelar la base genética para los patrones regulatorios espaciales observados.
