Этот протокол может быть использован для подготовки грибковых и растительных материалов для твердого ядерного магнитного резонанса, или ЯМР, и динамической ядерной поляризации, или DNP, экспериментов для сложной характеристики биосистемы. Этот метод позволяет исследовать биоматериалы до уровня атомного разрешения в их родной среде, например, в целых клетках. Приобретение высококачественной структурной информации о грибковых материалах поможет в разработке противогрибковых препаратов.
Метод дает представление о составе и структуре сложных углеводов в стенках грибковых клеток и может быть применен ко многим богатым углеводами организмам, включая растения, грибы, водоросли и бактерии. Некоторые исследователи могут бороться с грибкового загрязнения в их клеточных культур. Мой совет заключается в стерилизации среды и оборудования тщательно перед использованием для предотвращения этого загрязнения.
Эта демонстрация поможет следователям с небольшим опытом работы в ЯМР или клеточной культуры, чтобы узнать, как реализовать эти методы в грибковых и растительных систем. Для приготовления неофощенной жидкой среды роста растворяют 6,5 грамма дрожжевого экстракта пептона декстрозы или порошка YPD в 100 миллилитров дистиллированной воды, а затем автоклав полученного раствора в течение 25 минут при 134 градусах Цельсия. Чтобы подготовить неофощенный твердый рост среды, добавить 6,5 граммов YPD агар порошок 100 миллилитров дистиллированной воды, и автоклав среды в течение 25 минут при 121 градусов по Цельсию, до охлаждения среды примерно до 50 градусов по Цельсию.
Затем перенесите от 13 до 15 миллилитров расплавленной среды твердого роста в отдельные стерильные пластиковые блюда Петри и немедленно поместите крышки на посуду. Для подготовки углерода-13, азота-15 помечены жидкого роста среды, настроить 100-миллилитровый объем изотопов, содержащих минимальную среду до рН 6,6 с кислотой или базы по мере необходимости. Затем растворите соли, перечисленные в таблице в 100 миллилитров дистиллированной воды, добавьте в углерод-13, азот-15 помечены жидкой среды роста, и автоклав в результате раствор в течение 25 минут при 121 градусов по Цельсию.
Когда раствор остынет до комнатной температуры, добавьте 100 микролитров раствора микроэлементов к всему объему углерода-13, азот-15 помечены минимальной средой. Чтобы вырастить грибковые материалы, используйте интокуляции петли для передачи небольшого количества грибов из хранения на пластину YPD, и культуры грибок в течение двух дней в 30-градусный инкубатор по Цельсию. В конце инкубации используйте новую инокулятную петлю для переноса активно растущего грибкового края в углерод-13, на этикетке азота-15 жидкого роста среды, и поместите культуру на 30 градусов по Цельсию и 220 вращений в минуту в течение трех-пяти дней в трясущимся инкубаторе.
Когда большое количество гриба покрывают дно колбы и плавают в жидкости, собирать грибы центрифугации и отказаться от супернатанта. Гидрат гранулы с соответствующим раствором, и использовать типсы, чтобы собрать около 0,5 граммов хорошо увлажненной гранулы для ЯМР и DNP анализов. Затем смешайте оставшийся материал с раствором 20%глицерола в конической трубке и поместите грибковый образец при температуре минус 80 градусов по Цельсию для длительного хранения.
Чтобы подготовить A.fumigatus для твердотельных ЯМР-анализа, сначала используйте диализный мешок с 3,5-килодальтонным молекулярным весом, чтобы облизать 0,5-граммовый углерод-13, азот-15-маркированный грибковый образец против одного литра 10-миллимолярного фосфатного буфера при четырех градусах Цельсия в течение трех дней, чтобы удалить мелкие молекулы из среды роста. В конце диализа перенесите образец в 15-миллилитровую трубку для центрифугации и упакуйте от 70 до 80 миллиграммов равномерно маркированной и хорошо увлажненной образцовой пасты в четырехмиллиметровый ротор диоксида циркония. Используйте металлический стержень, чтобы аккуратно и повторно сжать образец, используя бумагу, чтобы поглотить избыток воды.
Затем плотно крышка ротора, и вставить образец в спектрометр для твердого состояния ЯМР характеристики. Чтобы подготовить A.fumigatus для анализа DNP, добавьте 100 микролитров матрицы DNP в один 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку на углерод-13, углерод-15-маркированный грибковый образец, и растворите 0,7 миллиграмма поляризационного агента к каждой трубке, чтобы сформировать 10-миллимолярный радикальный фондовый раствор. После вихря в течение двух-трех минут, чтобы убедиться, что радикалы полностью растворяются в растворе, замочите 10 миллиграммов обезболенного углерода-13, азот-15 помечены грибковый образец в 50 микролитров раствора поляризационного агента, и использовать пестик и раствор, чтобы мягко молоть смесь для обеспечения проникновения радикалов в пористые клеточные стенки.
Добавьте еще 30 микролитров радикального раствора в наземные гранулы для дальнейшего увлажнения грибкового образца и упакуйте гранулы в 3,2-миллиметровый сапфировый ротор. Сожмите мягко и удалить избыток растворителя DNP, как попродемонстрировано, и добавить 3,2-миллиметровый силиконовый штепсельной вилки, чтобы предотвратить потерю гидратации. Затем добавьте ротор в спектрометр ЯМР для рутинного эксперимента или спектрометр DNP для измерения спектра DNP-расширенного под микроволновым облучением.
Чтобы подготовить растительные материалы для исследований DNP, используйте лезвие бритвы, чтобы разрезать равномерно углерод-13-маркированный растительный материал на один-два миллиметра штук. Используйте раствор и пестик, чтобы измельчить кусочки на мелкие частицы, пока окончательный порошок имеет однородный вид. Добавьте 40 микролитров 10-миллимолярского раствора радикала в растительный материал и слегка измельчите образец еще на пять минут, чтобы обеспечить однородное смешивание с радикалом.
Увлажняйте образец грунта еще 20 микролитров радикального раствора, и упакуйте equilibrated образец растения в 3,2-миллиметровый сапфировый ротор для анализа DNP. Затем вставьте силиконовую вилку, чтобы избежать потери гидратации, и загрузите образец на спектрофотометр DNP. Изотопная маркировка существенно повышает чувствительность ЯМР и позволяет измерять серию двухмерных углерод-13-углерод-13 и углерод-13-азот-15 для анализа состава, гидратации, подвижности и упаковки полимеров для их интеграции для строительства трехмерной модели архитектуры клеточной стенки.
Если в спектре 2D-углерода-13-13 трудно получить внедиагнальные сигналы, то, возможно, имели место статистические маркировки. Два пика углерода-13 на 96 и 92 частей на миллион являются подписи углерода-1 сигналы глюкозы. Поэтому их сильная итензивсть в количественных спектрах прямой поляризации углерода-13, измеренных с длительными задержками рециркуляции в 35 секунд, обычно указывает на доминирование малых молекул из-за неполного диализа или стирки.
С хорошо помеченными образцами, долгосрочные корреляции могут быть дополнительно измерены для обнаружения пространственной близости биомолекул и построения структурной модели нетронутых клеточных стенок. Этот метод позволяет исследовать структуру многих природных и инженерных материалов, облегчая будущие исследования богатых углеводами биоматериалов и функционализированных полимеров. Как некоторые грибы могут вызвать инфекцию или систематические заболевания у людей, не забудьте обрабатывать грибковые материалы в ламинарный капюшон потока для защиты и свести к минимуму воздействие.
