Метод усиления парамагнитной релаксации может быть использован для характеризации и измерения межмолекулярных расстояний и количественной оценки переходных и/или малонаселенных биомолекулярных взаимодействий. Здесь мы применили этот метод для захвата взаимодействий, которые предшествуют конденсации белка. Чувствительность PRE позволяет идентифицировать, обнаруживать и количественно определять динамическое состояние с атомарным разрешением, которое остается невидимым и недоступным для других методов ЯМР.
Ключевые шаги в этом протоколе включают удаление несопряженной спиновой метки нитроксида и тщательный анализ спектров для точного измерения пиковой высоты. Кроме того, необходимо соблюдать осторожность при постановке эксперимента ЯМР и калибровке импульса. Для начала добавьте 3-малеимидо-ПРОКСИЛ из исходного раствора с 20-кратным молярным превышением интересующего изотопно меченого белка 15N.
Инкубируйте в течение ночи при комнатной температуре или четырех градусах Цельсия, защищенные от света и кислорода и с легким покачиванием или нутацией. На следующий день удалите непрореагировавшую этикетку свободного отжима, чтобы предотвратить попадание неспецифического растворителя PRE с помощью либо обширного диализа образца белка, либо с помощью гелевой фильтрации. Затем используйте реактив Эллмана для количественного определения свободных сульфгидрильных групп в растворе.
Измерьте абсорбцию с помощью микропланшетного ридера и постройте стандартную кривую. Для измерения внутримолекулярного PRE готовят изотопно обогащенный спин-меченый белок 15N до концентрации не менее 100 мкмольных, но не более 300 мкмольных, в буфере, подходящем для ЯМР. Затем с помощью стеклянной пипетки или микропипетки с длинным стержнем перенесите образец ЯМР в пятимиллиметровую ЯМР-трубку, подходящую для использования в высокопольных магнитах.
Поместите образец в магнит. Зафиксируйте дейтериевый сигнал с помощью команды lock, настройте и сопоставьте протонный канал в соответствии с протоколами объекта. Затем отрегулируйте регулировочные шайбы с помощью подпрограммы top spat, чтобы оптимизировать подавление сигнала растворителя.
Далее откалибруйте протонный импульс с помощью программы P-OPT. Затем откалибруйте импульс 15Н по стандартному образцу. Определите правильное затухание для сформированных импульсов с помощью подпрограммы инструмента «Форма».
Затем откройте соответствующий файл фигуры импульса, щелкнув значок папки. Сформированные импульсы находятся в разделе параметров импульсов параметров сбора. После загрузки файла определения импульса нажмите кнопку Analyze Waveform (Анализ формы сигнала), а затем Integrate Shape (Интегрировать форму).
Введите откалиброванный жесткий импульс протона под углом 90 градусов, желаемую форму длины импульса и вращение. Затем рассчитайте уровень мощности сформированного импульса, добавив изменение уровня мощности к затуханию для откалиброванного импульса под углом 90 градусов. Запишите стандартный протонный 15N HSQC для оптимизации ширины развертки, несущей частоты и проверки водоподавления.
Наконец, отрегулируйте ширину сдвига и количество косвенных приращений размеров с помощью команд SW и TD или непосредственно в соответствующих диалоговых окнах. Откалибруйте сформированные импульсы, как показано выше. Затем введите откалиброванную длину импульса в разделе «Параметры импульса» на вкладке «Параметры сбора».
Чтобы измерить амидный протон Т2 с помощью подхода с двумя точками задержки времени, задайте временные задержки, отредактировав файл списка VD. Первая задержка устанавливается равной 0,01 миллисекунды. Используя отношение к ожидаемому максимальному PRE, выберите вторую задержку.
Затем определите подходящее значение, сравнив первые приращения первого и второго спектров задержки и отрегулировав вторую задержку таким образом, чтобы сигнал затухал до 40-50% от его начального значения. Определите количество сложных точек для записи и количество сканирований для достаточного усреднения сигнала. Затем используйте команду EXPT для вычисления времени эксперимента и запустите эксперимент с помощью команды ZG. После растворения аскорбата натрия в буфере ЯМР отрегулируйте рН в соответствии с исходным буфером ЯМР.
Затем добавьте аскорбиновую кислоту в ЯМР-пробирку с 10-кратным молярным превышением концентрации спиновой метки, поместив каплю ниже края пробирки. Закройте тюбик крышкой и осторожно переверните, чтобы перемешать. Вращайте при 200–400 G в течение 10–20 секунд в центрифуге с ручным приводом, чтобы образец оседал на дне пробирки.
Завернув пробирку в фольгу, дайте реакции протекать не менее трех часов. Затем запишите амидный протон Т2 на диамагнитном образце, используя те же параметры, что и для парамагнитного образца. Внутримолекулярные амидные протонные гамма-ПЭ регистрировались на самоассоциативном внутренне неупорядоченном фрагменте, полученном из домена низкой сложности РНК-связывающего белка EWSR1.
Ожидается, что остатки, находящиеся в непосредственной последовательной близости от точки прикрепления спиновой метки, будут значительно расширены и не будут обнаруживаться в спектре. Остатки, которые были последовательно удалены от точки присоединения, но показали усиленную гамму, были пространственно близки к спиновой метке. В случае внутренне неупорядоченных белков регистрация и анализ пюре даст информацию о внутримолекулярных контактах и поверхностях переходных взаимодействий.
Сочетание измерений PRE с другими биофизическими методами, такими как динамическое рассеяние света, эксклюзионная хроматография, аналитическое ультрацентрифугирование и вычислительные методы, может обеспечить более глубокое понимание. Измерение PRE помогает охарактеризовать переходное малонаселенное состояние. Этот подход может быть расширен для характеристики взаимодействий, важных для множества биологических процессов, таких как молекулярное распознавание, аллостерический конформационный отбор и процессы сборки, включая сборку безмембранных органелл с помощью фазового разделения.
