Этот метод может помочь определить базовое распределение лобитической стволовой клетки после интраназальной доставки в мозг. Основным преимуществом этой методики является то, что облегчает неинвазивную доставку и отслеживание мезенхимальных стволовых клеток в мозг. Кроме того, несколько доз можно максимизировать терапевтические эффекты пересаженных клеток на хронической стадии после травм.
Этот метод максимизирует количество клеток, доставленных к месту повреждения и сводит к минимуму прогрессирование лобитической клетки в другие ткани. Хотя этот метод дает представление об использовании мезенхимальных стволовых клеток в травматических методов лечения черепно-мозговой травмы, он также может быть использован для исследования нетравматических травм головного мозга. Для мезенхимальной маркировки стволовых клеток супер парамагнитным оксидом железа добавьте шесть миллилитров маркировки среды до 80%-ной мезенхимальной культуры стволовых клеток в колбе T 75 для 24-часовой инкубации при 37 градусах цельсия и 5%углекислом газе.
На следующий день, тщательно аспирировать супер natant и мыть клетки два раза с шестью миллилитров PBS за стирку. Чтобы определить, были ли клетки успешно помечены, проверьте культуру под флуоресцентным микроскопом. Чтобы вызвать травму ТПП, подтвердив отсутствие реакции на педаль рефлекс, используйте электронные клиперы для бритья меха от спинной поверхности черепа, и очистить бритую область несколько раз с стерильным ватным тампоном пропитанной йодом.
Используйте ватный тампон, пропитанный 70%ethanol, чтобы удалить йод после последнего тампона и поместить животное в стереотаксическую рамку. Закрепай мышь ушными и носовые прутьями и сделайте 2,5-сантиметровый мидзагиттальный разрез в бритой коже, чтобы получить доступ к поверхности черепа. Используйте ватную палочку, чтобы удалить ткань, покрывающую череп, и очистить поверхность черепа в течение 10 секунд ватным тампоном, пропитанным 3%перекисью водорода.
Высушите череп свежей ватным тампоном и используйте карандаш, чтобы нарисовать четырехмиллиметровый круг вокруг координат выбора на открытой кости. Используя микросверло, оснащенное круглым буром диаметром 0,5 миллиметра, тщательно разжижайте череп на отмеченном круге без давления. Удалите любую костную пыль с чистым и сухим ватным тампоном и используйте стерильные поданные типсы, чтобы тщательно удалить полученный костной лоскут.
Когда dura mater был выставлен, перенесите мышь в стереотаксическую рамку устройства CCI, и закрепте животное с ухом и носом баров, так что голова находится на уровне в направлении рострокода. Следуя инструкциям на контрольной коробке, нулевой наконечник ударора к открытой поверхности коры с помощью X и Y управления колесами на базе ударного, чтобы выровнять наконечник ударного непосредственно над желаемыми координатами коры, которые будут удар. Используйте контрольную коробку, чтобы установить параметры эксперимента со скоростью пять метров в секунду, временем обитемого 250 миллисекунд и глубиной травмы в один миллиметр, чтобы вызвать легкую травму.
Затем нажмите кнопку удара на поле управления. Шваб любое кровотечение, которое происходит с стерильным ватным тампоном и удалить мышь из кадра. Закройте разрез шелковыми хирургическими швами и нанесите актуальные антибиотики на участок перед тем, как поместить мышь на грелку с мониторингом до полной лежачих времени.
На следующий день после травмы, лечить супер парамагнитного оксида железа помечены мезенхимальной культуры стволовых клеток с тремя миллилитров трипсина. Через пять минут при 37 градусах по Цельсию начните реакцию с семи миллилитров предварительно разогретой среды DMEM, дополненной сывороткой из 10% плода крупного рогатого скота, и соберите клеточную суспензию в 15-миллилитровую коническую трубку. Осадок клеток центрифугации и повторно приостановить гранулы в PBS для подсчета.
Затем отрегулируйте концентрацию клеток в 1,5 раза с 10 до пяти клеток на 18 микролитров PBS. Для доставки клеток, после подтверждения отсутствия ответа на щепотку ноша, потертый мыши при обездвиживания черепа. Поместите кончик пипетки, содержащей четыре единицы гиалуронидазы на микролитер PBS вблизи нара мыши под углом 45 градусов, и ввещайте три микролитера подвески гиалуронидазы в каждую ноздрю.
Поместите животное лицом вверх на чистую площадку в течение пяти минут, прежде чем повторить лечение четыре раза в общей сложности 100 единиц лечения гиалуронидазы. После последнего лечения, поместите мышь обратно на площадку в течение 30 минут, прежде чем сдерживать мышь, как только что продемонстрировали. С обездвиженным головой, управлять тремя микролитров мезенхимальной подвески стволовых клеток в каждую ноздрю в течение трех секунд на доставку раствора, удерживая мышь в положении в течение 30 секунд, пока образец капель полностью исчезли.
Через две минуты повторите доставку до трех раз, пока не будет доставлен весь объем мезенхимальной стволовой клетки. Затем верните мышь в клетку с контролем до полного лежачих времени. Чтобы отследить миграцию мезенхимальных стволовых клеток с помощью МРТ, поместите анестезированной мыши на держатель изображения MR-изображения.
Затем закрету животное на месте и перемести держатель в центр катушки МРТ. Установите время повторения до 1500 миллисекунд, а время эха до 2,8 миллисекунд. Затем установите поле зрения до 16 на 16 миллиметров, матрицу приобретения до 128 на 128, и толщину ломтика до 0,75 на 0,8 миллиметра с четырьмя средними сигналами и углом поворота 90 градусов, чтобы приобрести взвешенные T2 звезды сканирование с помощью последовательности спинового эхо.
После завершения сканирования, втягивать держателя мыши из центра катушки МРТ, и вернуть мышь в клетку с мониторингом до полного лежачих. Для отслеживания и количественной оценки помеченных мезенхимальных стволовых клеток на взвешенных изображениях звезды T2 откройте данные в программном обеспечении для привязки ИТ-кейса и выберите активную этикетку. Для создания сегментации областей hypointense и поражения или других частей мозга, представляющих интерес, используя различные цвета этикетки для каждого сегмента.
Используйте полигон инструмент в основной бар инструмент, чтобы выбрать области hypointense, которые представляют супер парамагнитного оксида железа помечены мезенхимальных стволовых клеток и нажмите принять. Сегментированные области будут отображаться в том же цвете, что и активная метка, присвоенная этому конкретному сегменту. Когда все ломтики были сегментированы, используйте скальпель инструмент для разработки 3D-карты сегментированных областей, чтобы представлять мезенхимальные распределения стволовых клеток во всем мозге.
Для проведения количественного анализа объема и интенсивности средних сегментированных областей hypointense, представляющих помеченные ячейки, щелкните сегментации и выберите объем и статистику. Через 24 часа после интраназальной доставки, супер парамагнитного оксида железа помечены мезенхимальных стволовых клеток обнаружены как сильные области hypointense медиальной корки травмы на T2 звезды взвешенных изображений, что свидетельствует о целенаправленной миграции супер оксида парамагнитного железа в место травмы. Эта миграция остается видимой до 14 дней после доставки без какого-либо заметного снижения сигнала.
Травмированные животные, обработанные PBS, не проявляют области гипойнтенса в любой момент времени, указывая, что наблюдаемые области гипойнтенса соответствуют супер парамагнитного оксида железа помечены мезенхимальных стволовых клеток, и не из-за сигнала артефактов. Биораспределения помечены мезенхимальных стволовых клеток могут быть визуализированы с помощью 3D реконструкции, гистологически прусского синего окрашивания, или флорескции обнаружения FITC помечены супер парамагнитного оксида железа в помечены мезенхимальных стволовых клеток. Обязательно проверяйте результаты МРТ с помощью эстологии или других методов.
Как супер магнитных частиц оксида железа может оставаться в тканях после смерти клетки, что приводит к ложным положительным сигналам. После этой процедуры, возможно умеренное неинвазивное отслеживание в количественной оценке может быть применено, чтобы ответить на вопросы, касающиеся оттачивания способностей и удержания мезенхимальных стволовых клеток в головном мозге. После этого развития, этот метод проложил путь для исследователей в области регенеративной медицины для изучения методов для улучшения оттачивания клеток в конкретных областях мозга.
