Этот протокол может быть использован и далее разработан для анализа того, как ионизирующее излучение влияет на набор опухолевых клеток, что приводит к более широкому пониманию рецидива рака. Органоиды молочной железы являются мощными моделями. Они имитируют основные характеристики in vivo, но позволяют легко от изоляции биологических переменных.
Использование низкоагезионых пластин сводит на нет проблемы рабочего потока, связанные с матрицами белка. Тройной отрицательный рак молочной железы пациенты испытывают местные региональные рецидивы с более высокими темпами после терапии. Изучение влияния радиации на опухоль и поведение иммунных клеток приведет к важному пониманию механизмов рецидивов.
Демонстрируя конфокаловую микроскопию органоидов, Хавьер Гомес, аспирант лаборатории Silvera Batista. Начните эту процедуру с удаления брюшной и паховой молочных желез от принесенных в жертву мышей, как описано в текстовом протоколе. Через 45 минут после облучения образцов, как описано в текстовом протоколе, поместите молочные железы в 35-миллиметровую стерильную клеточную пластину и фарш скальпелями.
Фарш с примерно 40 ударов, пока ткань расслабляется и куски получены, которые не больше, чем примерно один квадратный миллиметр в области. Теперь перенесите ткань в раствор коллагеназы в 50-миллилитровую центрифугу. Используйте 10 миллилитров раствора коллагеназы на мышь.
Поместите пробные трубки в водяную баню на 30-60 минут при 37 градусах цельсия, вихревая в течение пяти секунд каждые 10 минут. Пищеварение завершено, когда раствор коллагеназы мутный. Спин вниз усваивается раствор в 450 раз-G в течение 10 минут при комнатной температуре.
Сейчас наблюдаются три слоя. Супернатант состоит из жира, средний слой является aqueous раствор, а дно гранулы. Гранулы появляются красные, так как это смесь эпителиальных клеток, отдельных стромальных клеток и красных кровяных телец.
Предварительно покрыть все пипетки, пипетки советы, и центрифуги трубки с решением BSA до контакта путем добавления и удаления решения BSA. Решение BSA может быть использовано повторно, хотя оно должно быть стерилизован перед каждым экспериментом. Для дополнительного восстановления перенесите супернатант в свежую 15-миллилитровую трубку с покрытием BSA.
Pipette вверх и вниз энергично, чтобы разогнать жировой слой. Центрифуга образца в 450 раз-G в течение 10 минут при комнатной температуре. Аспирировать супернатант, оставляя небольшое количество средств массовой информации в трубке, чтобы избежать аспирации гранулы клетки.
Теперь аспирировать aqueous слой из трубки с оригинальной гранулы. Добавьте 10 миллилитров DMEM/F12 в трубку с оригинальной гранулой и перенесите во вторую трубку. Pipette энергично объединить и повторно использовать две гранулы.
После центрифугирования при 450-времени-G в течение 10 минут при комнатной температуре, аспирировать супернатант и добавить четыре миллилитров DMEM/F12 в трубку. Добавьте 40 микролитров дезоксирибонуклеазы в подвеску и аккуратно пожмите вручную в течение двух-пяти минут при комнатной температуре. Добавьте шесть миллилитров DMEM/F12 и пипетки тщательно.
После центрифугирования трубки в 450 раз-G в течение 10 минут при комнатной температуре, аспирировать супернатант до 0,5-миллилитровой отметки. Переусердуйте гранулы в 10 миллилитров DMEM/F12 и пипетки тщательно. Теперь центрифуга трубки, пульсирует до 450 раз-G и остановки четыре секунды после достижения этой скорости.
Повторите мытье шаги еще три раза, чтобы очистить органоиды с помощью центробежной дифференциации. Гранулы теперь должны быть небелого цвета, состоящий только из эпителиальных органоидов. Переусердуйте гранулы в 10 миллилитров DMEM/F12.
Pipette тщательно создать однородное решение. Перенесите 50 микролитров в 30-миллиметровую чашку Петри и просмотрите под фазо-контрастным микроскопом в 20X. Подсчитайте количество органоидов с счетчиком.
Pipette 50 микролитров органоидов в каждый колодец с низким содержанием пластины. Добавьте 150 микролитров органоидной среды, чтобы довести общий рабочий объем до 200 микролитров. Тщательно замените носитель каждые два дня.
Поддержание GFP или D-помидор помечены сырья 264,7 макрофагов в DMEM средств массовой информации дополняется 10%FPS и 1%пенициллин-стрептомицин. Семя клеток в органоидной среде при желаемой плотности. Используйте контраст фазы живых клеток и флуоресцентные изображения для мониторинга проникновения макрофагов с течением времени.
Удалите органоидную среду из скважин, тщательно аспирируя. Исправьте образцы с 10%neutral-буферным формалином в течение 15 минут при комнатной температуре. Вымойте фиксированные органоиды три раза в течение пяти минут в 1X PBS.
При желании, фиксированные образцы могут храниться при четырех градусах по Цельсию в течение одной недели для дальнейшего окрашивания. После мытья, permeabilize фиксированных органоидов в течение пяти минут. Блок фиксированных органоидов с 5%нормальной сыворотки козы в 0,1%PBST в течение одного часа при комнатной температуре перед стиркой три раза в течение пяти минут с PBS.
Инкубировать фиксированные органоиды с анти-цитокератин-14, E-кадерин, или плотно-соединения белка один, в 1%NGS в PBST в течение одного часа при комнатной температуре. Затем мыть три раза в течение пяти минут в PBST. Теперь инкубировать органоиды с козой анти-кролик вторичного антитела с 1%NGS PBST в течение одного часа при комнатной температуре.
Накройте фольгой, чтобы избежать воздействия света. После мытья, как и прежде, используйте ядерный краситель для окрашивания ядер в течение примерно получаса. Вымойте окрашенных органоидов в течение пяти минут в PBS три раза.
При использовании камерного слайда, смонтировать с крышкой скольжения. Храните органоиды, завернутые в фольгу при четырех градусах по Цельсию в течение двух недель. Облученное органоиды можно было бы обуделить в пластинах с низким содержанием адгезии или в мембране подвала, но наиболее быстрый рост произошел в низкоадезионное покрытие пластин.
Органоиды повторили характеристики молочной железы. Наблюдались конструкции, морфологически похожие на протоки и доли. Тенденции роста показали, что, когда органоиды были немедленно посеяны после пищеварения и сортировки, необлученные органоиды росли быстрее, чем облученные органоиды, скорее всего, из-за ареста роста клеток в результате механизмов восстановления повреждения ДНК.
Органоиды выражали эпителиальные характеристики, которые оценивались с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. Облученые органоиды выражали эпителиальные маркеры. Цитокератин-14, маркер миепителия, был сильно выражен на поверхности облученных органоидов.
Дополнительно, E-кадерин и туго-соединение протеин одно были выражены внутри клетчатые соединения organoids. Эти белки необходимы для правильной клеточной адгезии. После облучения органоиды продолжали сохранять свои эпителиальные характеристики.
Флуоресцентное окрашивание органоидов можно визуализировать в низкой адгезионой пластине с помощью флуоресцентной микроскопии. Однако самая ясная визуализация была получена с помощью конфокальные микроскопии. Исправлена общая интенсивность флуоресценции путем вычитания фона и нормализации по органоидной области.
Выращивание органоидов в 96-ну низкой адгезии пластин также упрощенные эксперименты совместной культуры. При сеяных в концентрациях, типичных в молочной железе, макрофаг колокализация увеличивается с облученными органоидами. При выполнении этой процедуры, самое главное помнить, чтобы не переваривать органоиды, и надлежащим образом очистить центробежной дифференциации.
После этой процедуры могут быть проведены дополнительные эксперименты по совместной культуре. Органоиды могут быть совместно культурированы с опухолевыми клетками, другими иммунными клетками и стромальными клетками для воссоздания облученной микроокноронности, связанной с рецидивом. Этот метод будет иметь важное значение для оценки того, как нормальное повреждение тканей конкретно влияет на динамику иммунных клеток, и в конечном итоге будет использоваться для понимания механизмов набора опухолевых клеток.
Органоиды молочной железы прояснены механизмы развития молочной железы, и надежно recapitulated рака молочной железы в пробирке. Мы надеемся, что наша модель дает представление о вербовке опухолевых клеток, вызванных радиацией.
