Este protocolo se puede utilizar y desarrollar para analizar cómo la radiación ionizante afecta el reclutamiento de células tumorales, lo que conduce a una mayor comprensión de la recurrencia del cáncer. Los organoides mamarios son modelos poderosos. Imitan las características básicas in vivo, pero permiten un fácil aislamiento de las variables biológicas.
El uso de placas de baja adherencia niega los desafíos de flujo de trabajo asociados con matrices de proteínas. Los pacientes con cáncer de mama triple negativo experimentan recurrencia regional local a tasas más altas después de la terapia. Estudiar cómo la radiación influye en el comportamiento del tumor y de las células inmunitarias conducirá a información importante sobre los mecanismos de recurrencia.
Demostrando microscopía confocal de los organoides es Javier Gómez, un estudiante de posgrado en el laboratorio Silvera Batista. Comience este procedimiento con la extirpación de las glándulas mamarias abdominales e inguinales de ratones sacrificados como se detalla en el protocolo de texto. 45 minutos después de la irradiación de las muestras como se describe en el protocolo de texto, coloque las glándulas mamarias en una placa celular estéril de 35 milímetros y picar con bisturíes.
Mince con aproximadamente 40 golpes hasta que el tejido se relaja y se obtienen piezas que no son más grandes que aproximadamente un milímetro cuadrado en el área. Ahora transfiera el tejido a la solución de colagenasa en un tubo centrífugo de 50 mililitros. Utilice 10 mililitros de solución de colagenasa por ratón.
Coloque los tubos de muestra en un baño de agua durante 30 a 60 minutos a 37 grados Centígrados, vórtrando durante cinco segundos cada 10 minutos. La digestión se completa cuando la solución de colagenasa está turbia. Gire hacia abajo la solución digerida a 450 veces-G durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Ahora se observan tres capas. El sobrenadante está compuesto de grasa, la capa media es una solución acuosa, y la parte inferior es un pellet. El pellet aparece rojo, ya que es una mezcla de células epiteliales, células estromales individuales y glóbulos rojos.
Precubre todas las pipetas, puntas de pipeta y tubos de centrífuga con solución BSA antes del contacto mediante la adición y eliminación de la solución BSA. La solución BSA se puede reutilizar, aunque debe filtrarse estérilmente antes de cada experimento. Para una recuperación adicional, transfiera el sobrenadante a un tubo de 15 mililitros recubierto de BSA.
Pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente para dispersar la capa de grasa. Centrifugar la muestra a 450 veces-G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante, dejando una pequeña cantidad de medios en el tubo para evitar aspirar el pellet celular.
Ahora aspirar la capa acuosa del tubo con el pellet original. Añadir 10 mililitros de DMEM/F12 al tubo con el pellet original, y transferir al segundo tubo. Pipeta vigorosamente para combinar y resuspender los dos pellets.
Después de centrifugar a 450 veces-G durante 10 minutos a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante y añadir cuatro mililitros de DMEM/F12 al tubo. Añadir 40 microlitros de desoxirribonucleasa a la suspensión y agitar suavemente con la mano durante dos a cinco minutos a temperatura ambiente. Agregue seis mililitros de DMEM/F12 y pipeta a fondo.
Después de centrifugar el tubo a 450 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante a la marca de 0,5 mililitros. Resuspender el pellet en 10 mililitros de DMEM/F12 y pipeta a fondo. Ahora centrifugar el tubo pulsando a 450 veces-G y deteniéndose cuatro segundos después de alcanzar esa velocidad.
Repita los pasos de lavado tres veces más para purificar los organoides a través de la diferenciación centrífuga. El pellet ahora debe ser un color blanquecino que consiste sólo en organoides epiteliales. Resuspender el pellet en 10 mililitros de DMEM/F12.
Pipetear a fondo para crear una solución homogénea. Transfiera 50 microlitros a una placa Petri de 30 milímetros y visualí y visualí y visualíe bajo un microscopio de contraste de fase a 20X. Cuente el número de organoides con un contador de recuento.
Pipeta 50 microlitros de organoides en cada pozo de una placa de baja adherencia. Añadir 150 microlitros de medio organoide para llevar el volumen total de trabajo a 200 microlitros. Sustituya cuidadosamente el medio cada dos días.
Mantener los macrófagos crudos 264,7 etiquetados con GFP o D-tomate en medios DMEM complementados con 10%FPS y 1%penicilina-estreptomicina. Siembra las células en el medio organoide con la densidad deseada. Utilice el contraste de fase celular en vivo y las imágenes fluorescentes para monitorear la infiltración de macrófagos con el tiempo.
Retire el medio organoide de los pozos aspirando cuidadosamente. Fije las muestras con una formalina 10% amortiguada neutra durante 15 minutos a temperatura ambiente. Lave los organoides fijos tres veces durante cinco minutos en 1X PBS.
Si lo desea, las muestras fijas se pueden almacenar a cuatro grados centígrados durante una semana para su posterior tinción. Después del lavado, permeabilizar los organoides fijos durante cinco minutos. Bloquee los organoides fijos con un suero de cabra 5% normal en 0,1%PBST durante una hora a temperatura ambiente antes de lavarlos tres veces durante cinco minutos con PBS.
Incubar los organoides fijos con anti-citoqueratina-14, E-cadherina, o proteína de unión apretada uno, en 1%NGS en PBST durante una hora a temperatura ambiente. Luego lave tres veces durante cinco minutos en PBST. Ahora incubar los organoides con anticuerpo secundario anti-conejo de cabra con 1%NGS PBST durante una hora a temperatura ambiente.
Cubra con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Después de lavar como antes, utilice el tinte nuclear para manchar los núcleos durante aproximadamente media hora. Lave los organoides manchados durante cinco minutos en PBS tres veces.
Si utiliza un portaobjetos de cámara, monte con un resbalón de cubierta. Almacene los organoides envueltos en papel de aluminio a cuatro grados centígrados durante un máximo de dos semanas. Los organoides irradiados podrían cultivarse en placas de baja adherencia, o dentro de la membrana del sótano, pero el crecimiento más rápido se produjo en placas de baja adherencia.
Características de la glándula mamaria recapitulada de organoides. Se observaron construcciones que son morfológicamente similares a los conductos y lóbulos. Las tendencias de crecimiento indicaron que cuando los organoides se siembran inmediatamente después de la digestión y la clasificación, los organoides no irradiados crecieron más rápido que los organoides irradiados, probablemente debido a la detención del crecimiento celular resultante de los mecanismos de reparación del daño del ADN.
Los organoides expresaron características epiteliales, que fueron evaluadas a través de la tinción inmunofluorescente. Los organoides irradiados expresaron marcadores epiteliales. Cytokeratin-14, un marcador de mioepithelium, se expresó fuertemente en la superficie de los organoides irradiados.
Además, la E-cadherina y la proteína de unión apretada se expresaron dentro de las uniones celulares de organoides. Estas proteínas son esenciales para una adecuada adhesión celular. Después de la irradiación, los organoides continuaron conservando sus características epiteliales.
La tinción fluorescente de organoides se podía visualizar dentro de placas de baja adherencia utilizando microscopía de fluorescencia. Sin embargo, la visualización más clara se obtuvo mediante microscopía confocal. Se calculó la intensidad total de fluorescencia se calculó restando el fondo y normalizando por área organoide.
El cultivo de organoides en las placas de baja adherencia de 96 pozos también simplificó los experimentos de co-cultivo. Cuando se siembra en concentraciones típicas en la glándula mamaria, la colocación de macrófagos aumentó con organoides irradiados. Al realizar este procedimiento, las cosas más importantes a recordar son no sobregerir los organoides, y purificar adecuadamente la diferenciación centrífuga.
Después de este procedimiento, se pueden realizar experimentos de codecultura adicionales. Los organoides se pueden coculvirar con células tumorales, otras células inmunitarias y células estromales para recrear el microambiente irradiado asociado con la recurrencia. Este método será importante para evaluar cómo el daño normal de los tejidos influye específicamente en la dinámica de las células inmunitarias, y eventualmente se utilizará para entender los mecanismos de reclutamiento de células tumorales.
Los organoides mamarios han aclarado los mecanismos del desarrollo de la glándula mamaria, y tienen cáncer de mama recapitulado robustamente in vitro. Esperamos que nuestro modelo proporcione información sobre el reclutamiento de células tumorales inducidas por radiación.
