Bu protokol, iyonlaştırıcı radyasyonun tümör hücre alımını nasıl etkilediğini analiz etmek için kullanılabilir ve geliştirilebilir ve kanser nüksünün daha iyi anlaşılmasına yol açabilmektedir. Meme organoidleri güçlü modellerdir. Temel in vivo özelliklerini taklit ederler, ancak biyolojik değişkenlerin kolayca izole edilmesine izin verirler.
Düşük yapışma plakalarının kullanımı protein matrisleri ile ilişkili iş akışı zorluklarını inkâr eder. Üçlü negatif meme kanseri hastaları tedavi sonrası daha yüksek oranlarda lokal bölgesel nüks yaşarlar. Radyasyonun tümör ve bağışıklık hücresi davranışını nasıl etkilediğinin araştırılması nüks mekanizmalarına ilişkin önemli içgörülere yol açacaktır.
Organoidlerin konfokal mikroskopisini gösteren Javier Gomez, Silvera Batista laboratuvarında yüksek lisans öğrencisi. Bu prosedüre, metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği şekilde kurban edilen farelerden karın ve inguinal meme bezlerinin çıkarılması ile başlayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi örneklerin ışınlama sonra 45 dakika, 35 milimetrelik steril hücre plakası ve neşter ile kıyma meme bezleri yerleştirin.
Doku rahatlayana kadar yaklaşık 40 vuruş ile kıyma ve alan yaklaşık bir milimetre den büyük parçalar elde edilir. Şimdi 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde kollajenaz çözeltisine doku aktarın. Fare başına 10 mililitre kollajenaz çözeltisi kullanın.
Örnek tüpleri 37 santigrat derecede 30 ila 60 dakika su banyosuna yerleştirin ve her 10 dakikada bir beş saniye girdap layın. Kollajenaz çözeltisi bulutlu olduğunda sindirim tamamlanır. Sindirilmiş çözeltiyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450-g'de aşağı doğru çevirin.
Şimdi üç katman gözlenmektedir. Supernatant yağ oluşur, orta tabaka sulu bir çözümdür, ve alt bir pelet olduğunu. Pellet kırmızı görünür, epitel hücreleri bir karışımı olarak, bireysel stromal hücreler, ve kırmızı kan hücreleri.
BSA çözeltisinin eklenmesi ve çıkarılması ile temas tan önce tüm pipetleri, pipet uçlarını ve Santrifüj tüplerini BSA solüsyonu ile ön katlayın. BSA çözümü yeniden kullanılabilir, ancak her denemeden önce steril filtreuygulanmalıdır. Ek kurtarma için, yeni bir BSA kaplı 15 mililitrelik tüp supernatant aktarın.
Pipet yukarı ve aşağı şiddetle yağ tabakası dağıtmak için. Numuneyi 450-0-G'de oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj edin. Süpernatant aspire, hücre pelet aspire önlemek için tüp içinde medya küçük bir miktar bırakarak.
Şimdi orijinal pelet ile tüpten sulu tabaka aspire. Orijinal peletle tüpe 10 mililitre DMEM/F12 ekleyin ve ikinci tüpe aktarın. Pipet şiddetle birleştirmek ve iki pelet yeniden askıya almak.
Oda sıcaklığında 10 dakika 450-kat-G santrifüj ettikten sonra, supernatant aspire ve tüp emme/F12 dört mililitre ekleyin. Süspansiyona 40 mikrolitre deoksiribonükle azmverin ve oda sıcaklığında 2-5 dakika hafifçe elle titretin. Altı mililitre DMEM/F12 ve pipeti iyice ekleyin.
Tüpü oda sıcaklığında 10 dakika 450-kat-G'de santrifüj ettikten sonra, süpernatant'ı 0,5 mililitrelik işaretine kadar aspire edin. Peleti 10 mililitre DMEM/F12 ve pipette iyice yeniden askıya alın. Şimdi tüpü 450 kat-G'ye kadar titreşerek ve bu hıza ulaştıktan sonra dört saniye durdurarak santrifüj edin.
Santrifüj farklılaşması ile organoidleri arındırmak için yıkama adımlarını üç kez daha tekrarlayın. Pelet artık sadece epitel organoidlerden oluşan beyaz olmayan bir renk olmalıdır. Peleti 10 mililitre DMEM/F12'de yeniden askıya alın.
Pipet iyice homojen bir çözüm oluşturmak için. 50 mikrolitreyi 30 milimetrelik Petri kabına aktarın ve 20X'te faz kontrastlı mikroskop altında görüntüleyin. Bir sayım sayacı ile organoidlerin sayısını sayMak.
Pipet 50 mikrolitre organoidin her bir kuyuya düşük yapışma plakası. 200 mikrolitre toplam çalışma hacmi getirmek için organoid orta 150 mikrolitre ekleyin. Dikkatle her iki günde bir orta değiştirin.
%10 FPS ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenen DMEM ortamlarında GFP veya D-domates etiketli ham 264,7 makrofajları koruyun. İstenilen yoğunlukta hücreleri organoid ortama tohum. Zaman içinde makrofaj infiltrasyon izlemek için canlı hücre faz kontrastı ve floresan görüntüleme kullanın.
Dikkatlice keserek kuyulardan organoid ortamı çıkarın. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %10 nötr tamponlu formalin ile düzeltin. 1X PBS'de sabit organoidleri beş dakika boyunca üç kez yıkayın.
İstenirse, sabit numuneler daha fazla boyama için bir hafta boyunca dört santigrat derecede saklanabilir. Yıkamadan sonra, beş dakika boyunca sabit organoidler permeabilize. Sabit organoidleri %0.1 PBST'de %5 normal keçi serumu ile oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edin ve pbs ile beş dakika boyunca üç kez yıkanın.
Sabit organoidleri anti-sitokeratin-14, E-kadherin veya sıkı bağlantı proteini olan, PBST'de %1 NGS'de oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Sonra PBST beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Şimdi oda sıcaklığında bir saat boyunca% 1 NGS PBST ile keçi anti-tavşan ikincil antikor ile organoidler kuluçka.
Hafif maruz kalmamak için folyo ile kaplayın. Daha önce olduğu gibi yıkadıktan sonra, yaklaşık yarım saat çekirdekleri leke lemek için nükleer boya kullanın. Lekeli organoidleri PBS'de beş dakika üç kez yıkayın.
Bir oda slayt kullanıyorsanız, bir kapak kayma ile monte. Folyoya sarılmış organoidleri dört santigrat derecede iki haftaya kadar saklayın. Işınlanmış organoidler düşük yapışma plakalarında veya bazal membran içinde kültürlenebilir, ancak en hızlı büyüme düşük yapışma plakalarında meydana gelmiştir.
Organoidler meme bezi özelliklerini recapitulated. Kanal ve loblara morfolojik olarak benzeyen yapılar gözlendi. Büyüme eğilimleri, organoidlerin sindirim ve sıralamadan sonra hemen tohumlandığında, ışınlanmamış organoidlerin ışınlanmış organoidlerden daha hızlı büyüdüğünü, büyük olasılıkla DNA hasar onarım mekanizmalarından kaynaklanan hücre büyümesi nedeniyle ortaya çıktıklarını göstermiştir.
Organoidler immünoresan boyama yoluyla değerlendirilen epitel özelliklerini ifade ettiler. Işınlanmış organoidler epitel belirteçlerini ifade ettiler. Sitokeratin-14, miyoepitelyum bir belirteç, güçlü ışınlanmış organoidlerin yüzeyinde ifade edildi.
Ayrıca, E-kadherin ve sıkı kavşak protein bir organoidlerin hücresel kavşakiçinde ifade edildi. Bu proteinler uygun hücre yapışması için gereklidir. Işınlama dan sonra, organoidler epitel özelliklerini korumaya devam ettiler.
Organoidlerin floresan boyama floresan mikroskopi kullanılarak düşük yapışma plakaları içinde görselleştirilebilir. Ancak en net görüntüleme konfokal mikroskopi ile elde edilerek elde edilebildi. Düzeltilmiş toplam floresan yoğunluğu arka plan çıkarılarak ve organoid alan tarafından normale döndürülerek hesaplandı.
96 kuyulu düşük yapışma plakalarında büyüyen organoidler de ortak kültür deneylerini basitleştirdi. Meme bezinde tipik konsantrasyonlarda tohumlandığında, ışınlanmış organoidlerle makrofaj kolokalizasyonu artmıştır. Bu işlemi gerçekleştirirken hatırlanması gereken en önemli şey organoidleri aşırı sindirmemek ve santrifüj farklılaşmasını uygun şekilde arındırmak.
Bu yordamı takiben, ek ortak kültür deneyleri yapılabilir. Organoidler tümör hücreleri ile birlikte kültürolabilir, diğer bağışıklık hücreleri, ve stromal hücreleri nüks ile ilişkili ışınlanmış mikroortamı yeniden oluşturmak için. Bu yöntem, normal doku hasarının özellikle bağışıklık hücre dinamiklerini nasıl etkilediğini değerlendirmek için önemli olacak ve sonunda tümör hücre işe alım mekanizmalarını anlamak için kullanılacaktır.
Meme organoidleri meme bezi gelişimi mekanizmaları açıklanmış var, ve in vitro sağlam recapitulated meme kanseri var. Biz modelradyasyona bağlı tümör hücre alımı hakkında anlayışlar sağlar umuyoruz.
