该协议可用于进一步发展，以分析电离辐射如何影响肿瘤细胞的招募，从而更好地了解癌症复发。乳腺有机体是强大的模型。它们模仿基本的体内特征，但它们允许容易分离生物变量。
使用低粘附板可抵消与蛋白质基质相关的工作流程挑战。三阴性乳腺癌患者在治疗后以较高的发病率经历局部区域复发。研究辐射如何影响肿瘤和免疫细胞行为将导致对复发机制的重要见解。
展示有机体共体显微镜的是哈维尔·戈麦斯，一个在西尔维娜·巴蒂斯塔实验室的研究生。从切除牺牲的小鼠的腹部和腹腺开始这个程序，详见文本协议。如文本协议所述，在照射样品后 45 分钟，将乳腺放在 35 毫米无菌细胞板中，用手术刀切碎。
在大约 40 次冲程下，直到获得不超过约 1 平方毫米的组织放松和片段。现在，在50毫升离心管中将组织转移到胶原酶溶液中。每只小鼠使用10毫升胶原酶溶液。
将样品管在37摄氏度下放在水浴中30至60分钟，每10分钟旋转5秒钟。当胶原酶溶液浑浊时，消化是完整的。在室温下，以 450 次-G 旋转消化溶液 10 分钟。
现在观察到三层。上清液由脂肪组成，中间层为水溶液，底部为颗粒。颗粒显示为红色，因为它是上皮细胞、单个频闪细胞和红血球的混合物。
在添加和去除 BSA 溶液之前，使用 BSA 溶液预涂所有移液器、移液器尖端和离心管。BSA 溶液可以重复使用，尽管每次实验前都应进行无菌过滤。要进行额外的恢复，请将上一液转移到新的 BSA 涂层 15 毫升管中。
向上和向下大力移液以分散脂肪层。在室温下以450倍-G离心样品10分钟。吸上一提液，在管中留下少量介质，以避免吸气细胞颗粒。
现在用原颗粒从管子中吸出水层。将 10 毫升 DMEM/F12 加入到管中，用原始颗粒将转移到第二管中。移液器大力组合和重新暂停两个颗粒。
在室温下以 450 次-G 离心 10 分钟后，吸升液，并将 4 毫升 DMEM/F12 添加到管子中。在悬浮液中加入40微升脱氧核素酶，在室温下轻轻握手2至5分钟。加入六毫升的DMEM/F12和移液器彻底。
在室温下以 450 次-G 离心管 10 分钟后，将上经器吸到 0.5 毫升标记。将颗粒重新在 10 毫升 DMEM/F12 和移液器中彻底。现在，通过脉冲到450次G和停止4秒后达到该速度的管离心。
重复洗涤步骤三次，通过离心分化净化器官。颗粒现在应该是一种非白色的颜色，只由上皮器官组成。将颗粒在 10 毫升 DMEM/F12 中重新暂停。
彻底移液，创造同质溶液。将 50 微升转移到 30 毫米培养皿中，并在 20 倍的相对比显微镜下查看。使用计数计数器计算器官的数量。
将50微升的有机体放入低粘附板的每个井中。添加150微升的有机介质，使总工作量达到200微升。每两天小心更换一次介质。
在DMEM介质中保持GSP或D-番茄标记的生264.7巨噬细胞，并辅以10%的FPS和1%青霉素链霉素。以所需的密度将细胞播种到器官介质中。使用活细胞相对比和荧光成像来监测巨噬细胞的渗透。
小心吸气，从井中去除有机介质。在室温下用10%中性缓冲的甲醛固定样品15分钟。在1X PBS中清洗固定器官三次，5分钟。
如果需要，固定样品可以在四摄氏度下储存一个星期，以进行进一步染色。洗涤后，将固定器官渗透五分钟。在室温下用5%正常山羊血清阻断固定器官，在室温下一小时，然后用PBS洗涤三次，用PBS洗5分钟。
用抗细胞素-14、E-卡德林或紧密结蛋白1，在PBST的1%NGS中孵育固定器官，在室温下孵育一小时。然后在 PBST 中洗三次，洗五分钟。现在用山羊抗兔二次抗体孵育器官，在室温下用1%NGS PBST孵育一小时。
用铝箔盖住，避免光线照射。洗完后，使用核染料染色核约半小时。在PBS中清洗染色的有机体五分钟。
如果使用腔室滑轨，则使用盖滑点安装。将包裹在四摄氏度的铝箔中的有机体储存长达两周。辐照的有机体可以在低粘附板或地下室膜内培养，但生长速度最快的发生在低粘附板中。
器官重述乳腺特征。观察了在形态上与管道和叶相似的构造。生长趋势表明，当器官在消化和分拣后立即播种时，非辐照器官的生长速度比辐照的器官快，很可能是由于DNA损伤修复机制导致细胞生长的阻止。
组织体表示上皮特征，通过免疫荧光染色进行评估。辐照的器官表示上皮标记。细胞素-14，一种明性氦的标记，在辐照的有机体表面强烈地表达。
此外，E-卡德林和紧密结蛋白一在器官的细胞结内表达。这些蛋白质对于适当的细胞粘附是必不可少的。辐照后，器官继续保持其上皮特征。
使用荧光显微镜，可以在低粘附板中显示器官的荧光染色。然而，最清晰的可视化是通过共和显微镜获得的。通过减去背景和按器官面积进行标准化来计算校正的总荧光强度。
96孔低粘附板中生长的器官也简化了共培养实验。当以乳腺中典型的浓度播种时，巨噬细胞结肠化随着辐照的器官增加而增加。执行此程序时，要记住的最重要的事情是不要过度消化有机体，并适当地净化离心分化。
按照此过程，可以执行其他共培养实验。有机物可以与肿瘤细胞、其他免疫细胞和频闪细胞共同培养，以重现与复发相关的辐照微环境。这种方法对于评估正常组织损伤如何具体影响免疫细胞动力学非常重要，最终将用于了解肿瘤细胞的招募机制。
乳腺器官已阐明乳腺发育的机制，并在体外有力地重述乳腺癌。我们希望我们的模型提供有关辐射诱导肿瘤细胞招募的见解。
