Это исследование представляет собой простую, универсальную и легкую систему для изучения различных фотодинамических эффектов на различные микроорганизмы и клетки. В этой системе светодиод может быть установлен в различную компоновку в зависимости от конструкции эксперимента. Различное состояние ФДТ может быть вычислено в 96-луночной пластине или даже 384-луночной пластине в одном эксперименте.
Этот метод может быть использован для лечения грибкового кератита, из-за которого во всем мире около 150 000 человек теряют глаза, несмотря на интенсивное лечение. Для начала вырежьте четыре зеленых светодиода из светодиодной ленты и выровняйте их с тремя колодцами 96-луночной пластины. Измерьте скорость флюенса светодиода на 540 нанометров с помощью измерителя мощности света.
Поддерживайте постоянную температуру в 25 градусов цельсия с помощью электрического вентилятора, который был собран рядом с пластиной во время облучения. С помощью стерильной петли выберите одну колонию Candida albicans из агаровой пластины и добавьте ее в стерилизованную стеклянную трубку, содержащую три миллилитра среды YPD. Инкубируйте трубку при 25 градусах Цельсия со скоростью вращения 155 об/мин в течение 14-16 часов, чтобы вырастить дрожжевую культуру.
Затем разбавляют культуру на ночь средой YPD до значения OD 600 0,5. Инкубируйте при температуре 30 градусов цельсия с вращением при 155 оборотах в минуту в течение четырех часов, чтобы достичь фазы роста бревна. Повторите разбавление культуры бревенчатой фазы свежей средой YPD до значения OD 600 0,65, чтобы получить примерно в один раз от 10 до седьмой колониеобразующих единиц на миллилитр.
Одновременно готовят 4%-ный раствор бенгальской розы в 1X PBS. Фильтр стерилизуют с помощью фильтра 0,22 микрометра. Добавьте 111 микролитров 2%-ного раствора бенгальской розы к одному миллилитру культуры логарифмической фазы и совместно культивируйте в разные моменты времени при комнатной температуре, чтобы понять поглощение RB в клетках.
Центрифугу при 16, 100 раз G в течение 2 1/2 минут при комнатной температуре и промыть кокультуру три раза одним миллилитром 1X PBS. После промывки повторно суспендируют культуру Candida albicans в одном миллилитре 1X PBS. Для каждого условия распределите культуру по трем различным скважинам в 96-луночной плите.
Выровняйте колодцы со светодиодной решеткой. В группах, выставленных на свет, включите электрический вентилятор и свет. После облучения выполняют десятикратное последовательное разведение дважды, взяв 20 микролитров раствора кокультуры из одной лунки и добавив его в пробирку, содержащую 180 микролитров 1X PBS.
Затем опустите 20 микролитров каждого серийного разведения в один квадрант агаровой пластины YPD, чтобы получить счетные колонии на пластине. Флуоресцентная микроскопия показала немедленное окрашивание Candida albicans с розовой бенгальской розой под красной флуоресценцией. После 15 минут инкубации большинство клеток были окрашены бенгальской розой, что указывает на то, что она входит в клетки зависимым от времени образом.
Кроме того, активация розовой бенгальской со светом генерирует свободные радикалы и синглетный кислород в клетках, что приводит к гибели клеток. При отсутствии бенгальской розы или облучения гибели клеток не наблюдалось. Candida albicans ингибировали после облучения зеленым светом в присутствии 0,2% розовой бенгалии легким дозозависимым способом.
Важно, что сначала 96-луночная пластина должна быть выровнена с центром светодиода. Во-вторых, используемая агаровая пластина должна быть тщательно высушена, чтобы предотвратить смешивание отдельных колоний. Candida albicans, которые выросли на пластине, могут быть дополнительно отправлены на генный анализ, который может ответить, как ФДТ влияет на экспрессию генов клеток.
Эти методы прокладывают путь к изучению того, как ФДТ работает на различных типах клеток, раковых клетках, бактериях, грибах или вирусах с помощью простой, недорогой и универсальной платформы.
