Этот протокол обеспечивает простой экономически эффективный способ изоляции ASCs без использования суровых ферментов или центрифугации шаги, которые могут изменить фенотип клетки и поведение. Отсутствие резких шагов дает меньше манипулируемых клеток, чем те, которые изолированы с помощью ферментов и центрифугации, сводя к минимуму вопросы о том, являются ли экспериментальные наблюдения артефактом метода изоляции. Этот метод explant может генерировать клинические соответствующие ASCs, которые будут введены в пациента для лечения различных заболеваний или расширить в жизни позволить себе научно-исследовательских приложений.
Трудно в полной мере объяснить метод заминки на словах. Визуальная демонстрация может служить другим ученым хлопот научиться распадать ткани сами. Подобные методы экспланта могут быть использованы для изоляции других популяций MSCs, таких как из пупочной ткани.
Чтобы измельчить образцы абдоминопластики, сначала перенесите ткань на крышку стерильной 100-миллиметровой пластины. Затем используйте стерильную иглу, чтобы держать кусок ткани на месте и использовать стерильный скальпель, чтобы разрезать ткань на менее чем один миллиметр штук. Перенесите ткань в свежую трубку и инвертировать или встряхнуть образец пять-шесть раз, чтобы обеспечить смешивание всех слоев.
Затем, с помощью стерильного шпателя, перенесите от 2,5 до 5 миллилитров ткани на 100-миллиметровую вакуумную газовую плазму, обработанную пластиной культуры тканей. Измерьте объем образца, вылив в свежую центрифугу трубку. Затем добавьте эквивалентный объем средств культуры тканей к пластине и аккуратно закружить пластину, чтобы смешать содержимое.
Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в пять процентов углекислого газа, пока достаточное количество клеток не будут видны на основании пластины. После того, как достаточное количество клеток отмечается на пластине или через семь дней, в зависимости от того, раньше, удалить все оставшиеся части ткани. Далее, культура ASCs в ткани культуры средств массовой информации, пока они не достигнут 70% слияния или до тех пор, пока кластеры становятся плотными, в какой момент клетки должны быть прохождение.
Аккуратно промойте пластину 1X фосфатом буферного солевого раствора. Чтобы трипсинизировать адепт клетки, аспирировать фосфат буфера солевого раствора, добавить один миллилитр трипсина дополняется 0,25%EDTA к каждой пластине и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Добавьте небольшое количество мультимедиа к пластине, чтобы отключить трипсин.
Затем аккуратно пипетки средства массовой информации трипсина из верхней части пластины вниз, потеря любых слабо прикрепленных клеток от пластины. Чтобы посеять клетки, сначала добавьте мультимедиа в тарелку. Затем добавьте клетки в dropwise образом, а затем вихрем пластины для обеспечения равномерного распределения по всей тарелке.
После трех проходов, приступить к потоку цитометрии и дифференциации анализов. После трех отрывков, изолированные ASCs из липоаспирата и абдоминопластики образцов было установлено, что морфология MSC и фенотип, похожий на изолированных ASCs после энзиматической пищеварения. Как и другие MSCs, эксплант изолированные ASCs являются отрицательными для CD45 и положительным для CD73, CD90 и CD105.
При заминки ткани, площадь поверхности каждого куска должна быть достаточно большой для ASCs мигрировать из ткани. Это фундаментальные стволовые клетки, которые могут быть использованы для широкого спектра применений. Изолированные ASCs могут быть использованы для любого приложения вниз по течению, in vivo или in vitro.
