Este protocolo fornece uma maneira simples e econômica de isolar ASCs sem o uso de enzimas duras ou etapas de centrifugação, que podem alterar o fenótipo e o comportamento das células. A falta de passos severos produz células menos manipuladas do que aquelas isoladas usando enzimas e centrifugação, minimizando questões sobre se observações experimentais são um artefato do método de isolamento. Este método de explant pode gerar ASCs relevantes clínicos para serem introduzidos em um paciente para tratar uma variedade de doenças ou expandir na vida para aplicações de pesquisa.
É difícil explicar completamente o método de picar em palavras. A demonstração visual pode servir a outros cientistas os problemas de aprender a quebrar o tecido eles mesmos. Métodos similares de explant podem ser usados para isolar outras populações de MSCs, como os de tecidos umbilicais.
Para picadinho das amostras de tecido de abdominoplastia, primeiro transfira o tecido para a tampa de uma placa estéril de 100 milímetros. Em seguida, use uma agulha estéril para segurar um pedaço de tecido no lugar e use um bisturi estéril para cortar o tecido em pedaços de menos de um milímetro. Transfira o tecido para um tubo fresco e inverta ou agite a amostra de cinco a seis vezes para garantir a mistura de todas as camadas.
Em seguida, com uma espátula estéril, transfira de 2,5 a cinco mililitros de tecido para uma placa de cultura de tecido de plasma de gás a vácuo de 100 milímetros. Meça o volume da amostra derramando em um tubo de centrífuga fresco. Em seguida, adicione um volume equivalente de mídia de cultura tecidual à placa e gire suavemente a placa para misturar o conteúdo.
Incubar a placa a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono até que um número suficiente de células sejam vistas na base da placa. Uma vez que um número suficiente de células são notadas na placa ou após sete dias, o que for mais cedo, remova todos os pedaços restantes de tecido. Em seguida, cultura os ASCs na mídia de cultura tecidual até atingir 70% de confluência ou até que os aglomerados se tornem densos, momento em que as células devem ser passagemdas.
Enxágue suavemente a placa com salina tamponada de fosfato 1X. Para tentar experimentar as células aderentes, aspire a solução salina tamponada de fosfato, adicione um mililitro de trippsina suplementado com 0,25% EDTA em cada placa e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos. Adicione uma pequena quantidade de mídia à placa para desativar a trippsina.
Em seguida, pipeta suavemente a trippsina de mídia do topo da placa para baixo, perdendo quaisquer células fracamente ligadas da placa. Para semear as células, primeiro adicione mídia à placa. Em seguida, adicione as células de forma dropwise e, em seguida, gire a placa para garantir uma distribuição uniforme através da placa.
Após três passagens, prossiga para os ensaios de citometria e diferenciação. Após três passagens, foram encontradas asCs isoladas de amostras de lipoaspirato e abdominoplastia com morfologia e fenótipo de MSC, semelhantes aos ASCs isolados após uma digestão enzimática. Como outros MSCs, as ASCs isoladas de explanta são negativas para CD45 e positivas para CD73, CD90 e CD105.
Ao picar o tecido, a área de superfície de cada peça deve ser suficientemente grande para que as ASCs migrem para fora do tecido. Estas são células-tronco fundamentais que podem ser usadas para uma ampla gama de aplicações. Os ASCs isolados podem ser usados para qualquer aplicação a jusante, in vivo ou in vitro.
