Последовательная блочно-лицевая сканирующая электронная микроскопия обеспечивает беспрецедентный взгляд на трехмерные тканевые ультраструктуры и может ответить на множество вопросов, которые ранее были невозможны или чрезвычайно трудны для выполнения. Этот метод позволяет быстро и воспроизводимо производить трехмерные наборы данных с минимальной зарядкой тканей и артефактами. И что важно, он позволяет автоматически захватывать тысячи изображений ежедневно.
Стандартная просвечивающая электронная микроскопия обеспечивает отличную клеточную ультраструктуру. Однако эти изображения не имеют трехмерного контекста и могут быть трудными для интерпретации. Последовательная блочно-лицевая сканирующая электронная микроскопия обеспечивает трехмерный контекст, позволяющий интерпретировать сложные процессы.
Хотя этот протокол является надежным и воспроизводимым, некоторые шаги требуют точности и критически важны для успеха этой методологии. Это видео продемонстрирует эти критические шаги в деталях. После фиксации образцов в 0,1-молярном буфере какодилата натрия, содержащем 2,5% глутарового альдегида, и два миллимолярных хлорида кальция образцы следует разрезать на блоки размером не более двух миллиметров, обмотанные кубиками, и промыть 0,1-моляром какодилатно-натриевым буфером, содержащим два миллимолярных хлорида кальция.
Затем ткань последовательно окрашивают ферроцианидом осмия, тиокарбогидразидом и тетроксидом осмия. После инкубации тетроксида осмия обработайте ткань 1% водным уранилацетатом при четырех градусах Цельсия в течение ночи. На следующее утро растворите 0,066 грамма нитрата свинца в 10 миллилитрах 0,03 молярного раствора аспарагиновой кислоты и используйте один нормальный гидроксид калия для регулировки рН раствора аспартата свинца Уолтона до 5,5.
После нагревания раствора в духовке промыть ткань пять раз в течение трех минут за стирку при комнатной температуре, дважды дистиллированной водой, перед переносом ткани в подогретый раствор аспартата свинца Уолтона при 60 градусах Цельсия. В конце инкубации промыть ткань и обезвоживать ее в восходящем ледяном ацетоновом ряду с последующим 10-минутным инкубированием в ацетоне комнатной температуры. Затем поместите ткань в соотношение 1:3 твердо смешанной смолы в ацетоне в течение четырех часов инфильтрации на вращающейся платформе с последующей восьмичасовой или ночной инфильтрацией в соотношении смолы к ацетону 1:1 на вращающейся платформе, затем, ночная инфильтрация в соотношении смолы к ацетону 3:1 на вращающейся платформе.
На следующее утро проникают в ткань свежей 100% смолой в течение одного четырех-восьмичасового, одного на ночь и одного четырехчасового инфильтрата при комнатной температуре на вращающейся платформе. На следующее утро используйте деревянную палочку, чтобы смешать небольшое количество смолы с порошком технического углерода, пока смола не насытится порошком, но все еще будет жидкой и не станет зернистой. Резиденция должна напоминать толстые чернилки и иметь возможность медленно капать без видимых комков Поместите образец ткани в силиконовую резиновую форму и захватите изображение для последующего использования ориентации образца в блоке смолы.
Когда образец будет на месте, покройте ткань насыщенной смолой технического углерода на кончике силиконовой формы, с этикеткой, указывающей экспериментальные и тканевые детали в форме на противоположном конце смолы. Затем поместите форму в духовку с 65 градусами Цельсия под наклоном примерно на один час. Когда смола, наполненная сажимом, достаточно отверждется, удалите форму из духовки и, начав с пустого колодца, заполните оставшуюся часть формы прозрачной смолой, позаботясь о том, чтобы этикетка оставалась видимой.
Когда образец будет покрыт прозрачной смолой, поместите силиконовую форму обратно в печь с 65 градусами Цельсия, не на наклоне, в течение 48 часов, а затем удалите форму. Чтобы подготовить блок к визуализации, поместите образец, встроенный в смолу, на микротомный патрон с конусным концом, торчащий примерно на пять-шесть миллиметров из патрона. Зафиксируйте образец на месте с помощью установленного винта и поместите образец под тепловую лампу.
Через несколько минут поместите патрон в держатель стереомикроскопа и используйте новое, обоюдоострое лезвие бритвы, чтобы сделать тонкие участки параллельно лицевой стороне блока, пока ткань не станет видимой, которая будет менее отражающей и зернистой по сравнению с частями смолы, которые лишены ткани. Закрепите алюминиевый штифт в держателе обрезного штифта и сделайте несколько глубоких, пересекающихся царапин на лицевой стороне штифта, чтобы обеспечить большую площадь поверхности для клея, используемого для удержания образца на месте. Поместите образец под тепловую лампу и протолкнуйте бритву на один-два миллиметра прямо вниз в смоляной блок, прежде чем сделать второй, перпендикулярный срез равной глубины в блоке, чтобы отрезать избыток смолы от образца ткани так, чтобы блок был примерно три миллиметра в диаметре и два-три миллиметра в высоту.
После этой первоначальной обрезки снова прогрейте блок под тепловой лампой и используйте новое, обоюдоострое лезвие бритвы, чтобы отрезать верхнюю часть смоляного блока примерно на один миллиметр ниже обрезанной части одним гладким срезом. Поместите держатель обрезного штифта, содержащий разрезанный алюминиевый штифт, в сосуд стереомикроскопа и нанесите тонкий слой цианоакрилатного клея на лицевую сторону булавки таким образом, чтобы она полностью закрывала штифт, не образуя видимого мениска. Используйте щипцы, чтобы прижать обрезанный кусок блока ткани к центру образца заколки в течение нескольких секунд и дать клею схватиться в течение нескольких минут.
Когда клей тщательно высохнет, найдите ткань на приподнятой части смоляного блока и используйте обоюдоострую бритву, чтобы обрезать приподнятую часть смолы, содержащую образец ткани, до площади не более одного квадратного миллиметра. Медленно и осторожно удалите как можно больше избытка смолы, оставив блок немного длиннее в одном измерении, и используйте конечный металлический файл, чтобы направить избыток смолы в область за пределами поднятой части, содержащей образец ткани, вниз к краю штифта. Удалите частицы смолы и пыли из подготовленного образца перед нанесением тонкого слоя серебряной краски и напыления золота на всю поверхность блока образцов.
После нанесения покрытия обрежьте излишки серебристой краски с лицевых поверхностей блока и поместите установленный и обрезанный блок в луковичный конец изготовленной на заказ трубки для переноски пипетки с прикрепленной соответствующей этикеткой. Используя визуализацию SBF-SEM, сеть пучков микрофибрила без эластина была идентифицирована в роговице взрослой мыши. Эта сеть организована в отдельные слои, причем волокна тесно связаны с кератоцитами, даже лежат в неглубоких инвагинациях на поверхности кератоцитов.
Применение этого протокола привело к открытию ранее неизвестной популяции центральных нервов роговицы, которые сливаются с базальными эпителиальными клетками на стромально-эпителиальной границе. SBF-SEM визуализация центральной роговицы показывает наличие лимбальной сосудистой, нервных пучков и связанных с ними клеток, которые могут быть вручную сегментированы для 3D-реконструкции. Некоторые подводные камни этой процедуры визуализации включают использование слишком длительного времени выдержки пикселя, что может привести к тому, что последующие изображения будут волнистыми и искаженными, небольшие разряды электронов из грани блока, приводящие к быстрым изменениям контраста в линиях, царапинам ножа на лицевой стороне блока из-за поврежденного ножа или скоплению мусора на краю ножа. , артефакты из расширенного электронного пучка фокусируются на лицевой стороне блока, пока образец все еще находится в камере визуализации, неправильная фиксация тканей, приводящая к разделению клеточных структур и соединительной ткани, и пропуск изображения в результате большого количества зарядки внутри ткани или смоляного блока.
При разрезании блока тканей важно иметь хорошее понимание того, где ткань находится внутри блока, чтобы случайно не обрезать какие-либо важные области образца. Если желательны изображения с более высоким разрешением конкретных клеточных структур или взаимодействий, визуализация может быть остановлена, блок удален из микроскопа, а участки вырезаны на ультрамикротоме, где их можно увидеть в просвечивающий электронный микроскоп Последовательная блочная сканирующая электронная микроскопия позволяет получить совершенно уникальный вид биологических тканей. Используя этот протокол, мы смогли быстро получить качественные наборы данных и расширить диапазон тканей, которые мы можем исследовать.
