Этот протокол может быть использован для создания пациентов полученных ксенотрансплантатов, которые резюмируют гистопатологии венозных пороков развития. Это было также разрешено провести наше доклинкическое терапевтическое тестирование. Этот метод обеспечивает быструю и надежную систему NVivo, которая позволяет ежедневно контролировать рост прямых эндотелиальных клеток пациента и реакцию на экспериментальную терапию.
Этот метод может быть легко адаптирован для исследования других типов сосудистых или лимфатических аномалий. Начните с подготовки клеточной подвески для инъекций. Трипсинизировать эндотелиальные клетки с пятью миллилитров предварительно разогретых 0,05%tripsin-EDTA при 37 градусах по Цельсию в течение двух минут.
Нейтрализуй трипин и добавив пять миллилитров EGM и соберите клетки в 150 миллилитров конической трубки. Центрифуга его до 400 раз G в течение пяти минут, то аспирировать супернатант и повторно использовать клетки в три миллилитров EGM. Подсчитайте клетки с гемоцитометром.
Венчурный объем с желаемым номером клетки в новую 50 миллилитров конической трубки и гранулы клетки снова центрифугации. Аспирировать супернатант оставляя небольшой объем, чтобы ослабить гранулы клетки. Повторное использование клеточных гранул с 220 микролитров BMEM за инъекцию.
Смешайте подвеску клетки тщательно на льду убедившись, чтобы избежать создания пузырьков. Аспират культуры клеток BMEM смешивается в один миллилитр шприц открытия, потянув поршень. Вы заблоките стерильную иглу 26 калибра к шприцу и держите подготовленные шприцы плоскими на льду перед инъекцией.
После обеспечения того, чтобы мышь правильно анестезировала место его на животе и дезинфицировать область инъекций с 70% этанола. Аккуратно свернуть подготовленный шприц, чтобы повторно использовать любые урегулированные клетки. Хлопья пузыри до конца шприца и изгнать небольшой объем клеточной подвески.
Pinch кожи на месте инъекции, чтобы создать палатку, как структура. Затем вставьте иглу прямо под кожу и убедитесь, что игла только глубокой кожи, выпустив щепотку кожи, чтобы предотвратить инъекцию в мышечную ткань. Держа иглу неуклонно вводить 200 микролитров клеточной подвески для создания небольшой сферической массы.
Позаботьтесь, чтобы избежать введения клеточной суспензии в мышцы. Измерьте длину и ширину каждой вилки с помощью калипера. Выровнять расчлененные пробки ксенотрансплантата на разделоченной доске рядом с линейкой и сделать снимок, чтобы зафиксировать брутто васкулярность поражений.
Затем исправить пробки, погружая их в 10%formalin ночь при комнатной температуре. После вскрытия, поражения пробки обрабатываются для гистологического анализа и окрашенных для UEA-1 для обнаружения человека производных эндотелиальных клеток в штепсельной вилке. Возьмите пять изображений HPF в разделе поражения с ярким полевым микроскопом при увеличении 20 X в структуре плоскости X в разделе поражения, чтобы избежать перекрытия.
Убедитесь в том, чтобы включить планку масштаба на сделанных изображениях. Откройте изображения HPF на изображении J.To калибруйте пиксели бара масштаба, используйте инструмент прямой линии и перейдите планку масштаба. Затем конвертируйте измеренные пиксели в миллиметры, нажав на Analyze и Set Scale.
Следующий клик по анализу установить измерения и выбрать область и добавить к наложению. Измерьте общую площадь поля HPF с помощью анализа и измерения сохранения этого измерения для количественной оценки. С помощью инструмента свободного выбора рук вручную начертить положительный сосудистый канал UEA-1.
Нажмите на анализ и измерение для количественной оценки изложенной области. Измерьте все сосудистые каналы в рамках HPF. Повторите процесс для пяти HPF, принятых в каждом разделе, и перенесите значения в Excel для дальнейшего анализа.
Затем вычислите процент сосудистой области и плотности сосудов в соответствии с рукописными направлениями. Используя этот протокол поражения пробки с TIE2 или PIK3CA гиперактивных мутантных эндотелиальных клеток заметно васкуляризированы и проникнуты в течение семи-девяти дней после инъекции. Поражения пробки очень напоминают гистопатологические особенности ткани человека VM и большие сосудистые каналы выровнены тонким слоем эндотелиальных клеток видны.
Эти сосудистые структуры обычно содержат эритроциты, подтверждающие функциональный анастомоз с васкулатурой мыши-хозяина. Иммуногистохимическое окрашивание с использованием человеческого специфического лектина UEA-1 подтверждает, что клетки, выстилающие сосудистые области, являются производными от имплантированных клеток человека, а не сосудов мыши. После этой процедуры, дополнительное окрашивание разделов поражения для маркеров пролиферации или апоптоза может быть выполнено для анализа конкретных эффектов экспериментального лечения.
Эта сценографическая модель была использована для доклинических исследований новых методов лечения венозной мальформации, таких как ингибитор рапамицин mTOR, который показал эффективность в нескольких клинических испытаниях для пациентов с ВМ.
