Наш протокол демонстрирует всеобъемлющий доклинический рабочий процесс для тестирования терапевтической эффективности человеческих плюрипотентных стволовых клеток после черепно-мозговой травмы. Эта модель черепно-мозговой травмы обеспечивает высокую степень универсальности и воспроизводимости, жестко контролируя параметры механической силы и, следовательно, обеспечивая четко определенные травмы. Эти процедуры могут быть использованы для изучения травм и процессов восстановления в других областях мозга и метод трансплантации является подложным для использования со многими типами клеток.
Краниальное бурение является сложной задачей, поскольку техника требует ловкости рук, чтобы освоить соответствующее давление, скорость, глубину и плавные движения. Документировать все события и практики широко. Чтобы выполнить одностороннюю черепно-мозговую операцию, подтвердите отсутствие реакции на щепотку носа в обезболивающей мыши и закрените мышь в стереотаксисе.
Нанесите офтальмологическую мазь на глаза стерильным ватным тампоном и раствором на основе йода в область бритой кожи головы. Удалить йод с 70%этанола и покрыть животное с фенестированной хирургической драпировки. Сделать 1,5 до двух сантиметров средней линии разреза на кожу головы и использовать стерильные ватные тампоны для очистки раны и очистить фасции слева от средней линии на брегме.
Используйте ударный зонд для идентификации сайта краниэктомии и установите x равно нулю, у равна нулевой стереотаксисной точке отсчета к брегме. Отрегулируйте зонд боково до двух миллиметров слева от средней линии. Используйте тонкий наконечник хирургически безопасный маркер, чтобы ориентир пять миллиметров диаметром круг вокруг предполагаемой области удара.
Поднимите и поверните ударник из положения и заполнив пятимиллиметровый круг. Кратко верните ударник в положение, чтобы проверить точность пятимиллиметрового круга. Затем поднимите и поверните ударник из положения и используйте высокоскоростной роторный микродвигатель ручной инструмент, оснащенный круглым наконечником 0,6 или 0,8 миллиметра заусенцев, чтобы сделать открытое отверстие в черепе на 70-80% максимальной скорости.
Нанесите световое давление на череп во время бурения вдоль пятимиллиметрового окружного контура в пределах этой границы и используйте типсы для подъема полученного костного лоскута. Бурение через линии шва может представлять дополнительную трудность, так как кость прерывается и требует дополнительного давления. Кровеносные сосуды могут быть в тесной связи и, следовательно, кровотечение события, вероятно.
Чтобы вызвать легкую контролируемую травму коркового удара, очистите зонд ударора стерильной подготовительной площадкой для алкоголя и переместите зонд ударора обратно в положение над открытой корой. Опустите зонд до тех пор, пока он не коснется поверхности dura mater и не отметит это положение как z равно нулю. Свяжай поршень и двигайся к z равен минус одному миллиметру и разряжай поршень, чтобы повлиять на кору.
Немедленно поднимите поршень и переместить руку из положения и орошать кору с щедрым объемом солевого раствора и использовать простые прерванные стежки и 5-0 шелковый шов, чтобы закрыть разрез кожи головы. Затем доставить 10 миллиграммов на килограмм циклоспорина А путем подкожной инъекции в потертости и поместить мышь в чистую предварительно разогретую послеоперационную клетку с наблюдением до полного выздоровления. Примерно через 24 часа после краниэктомии поместите мышь обратно в стереотаксисную рамку.
Обложка мыши с фенестированной хирургической драпировки. Lavage разрез сайт с стерильным солевым раствором, чтобы очистить сайт и ослабить швы. Используйте 70% этанола пропитанной ватным тампоном, чтобы аккуратно стерилизовать место разреза и использовать тонкие пинцет и офтальмологические ножницы, чтобы удалить швы.
Затем орошать хирургии и краниэктомии сайт с обильным стерильным солевым раствором. В клеточной культуре биобезопасности капот, осторожно вихрем или нажмите трубку клеток, чтобы обеспечить однородную подвеску клеток. Используйте микропипюту для загрузки примерно 7,5 микролитров клеток в шприц Гамильтона через конец поршеня.
Держа шприц под углом 120 градусов с поршенем конца лицом вниз, вставьте поршень заботясь, чтобы не ввести пузырь воздуха между подвеской и поршень отзыв. Прикрепите сборку прокладки к игле пипетки и прикрепите иглу к шприцу. Нажмите поршень, чтобы переместить подвеску клетки в трубчатую иглу и прикрепить шприц к стереотаксисному шприцу насоса.
Предварительный поршень, чтобы убедиться, что сборка шприц насоса работает должным образом и переместить иглу в координаты для инъекции. Выровняй кончик иглы до брегмы и установите х и у-координаты до нуля. Перемести иглу опрокинуть краниэктомию на два миллиметра боковой и минус один миллиметр задней к брегме и коснуться кончика иглы к поверхности dura mater.
Поднимите иглу немного затем сделать небольшой разрез в dura матер в месте, где игла в контакте. Установите стереотаксис координаты до z равен нулю и нажмите поршень, чтобы подтвердить, что подвеска клетки течет адекватно перед введением иглы в мозг. Введать иглу в мозг на глубину z равно минус 1,4 миллиметра, чтобы поместить трансплантат на серый вещества / белого вещества границы глубокой коры.
Запустите шприц-насос, чтобы наполнить cell suspension в течение 15-минутного периода. Используйте микроскоп дальнего следования для мониторинга оттока клеточной суспензии, орошающей хирургическое вмешательство стерильным солевым раствором во время инъекции для поддержания гидратации тканей. Когда все клетки были доставлены, медленно снять трансплантации иглы и орошения хирургии сайт с дополнительным солевым раствором перед закрытием разреза с новыми швами.
Затем доставить послеоперационную помощь, как это было продемонстрировано. Для теста на удаление клейкой ленты сначала используйте небольшой бритвенный нож, чтобы разрезать желтые и красные кусочки электрической ленты на полоски три на пять миллиметров на гладкой стеклянной поверхности. Принесите мышей в комнату тестирования поведения, по крайней мере за 30 минут до тестирования и использовать обработку ткани для сдерживания мыши за потертости шеи и спины так, что мышь держит forepaws от его тела и головы.
Используйте пинцет, чтобы поместить клей полосу на подошве каждого передний лапа и использовать тонкий и последовательный палец давление для обеспечения полосы лапы. Быстро поместите мышь в пластиковый цилиндр и запустите два секундомера, когда мышь имеет все четыре лапы на пластиковой коробке тестирования. Затем используйте два секундомера для записи latencies для левой лапы уведомления, удаление левой лапы, правую лапу уведомления и удаление правой лапы.
В этом экспериментальном эксперименте функцию forelimb сравнивали только с краниэктомией, контролируемой травмой коркового удара и наивными мышами. Мыши, которые прошли операцию выставлены переходные повышенной latencies заметить клей стимулы в течение одного-трех дней сразу после операции и переходных послеоперационных дефицитов в клей удаления из ипсилатеральной типы. Мыши, которые подверглись контролируемому корковому воздействию, однако, продемонстрировали значительный дефицит двигательных характеристик в передняя часть против травмы по сравнению с наивными мышами из послеоперационного дня 28.
Иммуностеинирование секций мозга мыши для ядерного антигена человека показывает, что трансплантаты клеток человека можно четко отличить от тканей-хозяина при травме ШАМ и контролируемом корковом воздействии мозга. Вы должны соблюдать стандартные лабораторные процедуры безопасности при обработке культурных клеток человека и при обращении шприц иглы, которые вступают в контакт с грызунами или иммуносупрессивных препаратов. Секции тканей мозга могут быть проанализированы для выражения нейровоспламеня маркеров, как это ценно знать, как трансплантат влияет на реакцию травмы ткани хозяина и наоборот.
Мы были удивлены, чтобы найти тонкие половые различия в результатах поведения после травмы. В настоящее время мы расследуем ли секс играет определенную роль в нейроиммуне ответ на черепно-мозговую травму. Устойчивые руки, терпение и практика имеют решающее значение для разработки хорошей техники краниэктомии.
Сопутствующий ущерб от неправильной краниэктомии может поставить под угрозу область, которую вы хотите, чтобы цель для трансплантации клеток.
