Трансплантация индуцированной человеком плюрипотентной микроглии, полученной из стволовых клеток, в мозг иммунокомпетентных мышей неинвазивным трансназальным путем

Этот протокол позволяет проводить неинвазивную трансплантацию iPSMG в иммунокомпетентный мозг мыши путем сочетания фармакологического включения/выключения антагониста рецептора CSF1 PLX5622 с трансназальной трансплантацией. Основным преимуществом этой методики является то, что iPSMG можно пересаживать, не вызывая повреждения головного мозга даже у иммунокомпетентных мышей. Трансплантация микроглии может служить потенциальной терапией для обмена дисфункциональными микроглиями с функциональными при различных нейродегенеративных заболеваниях в будущем.

Продемонстрировать процедуру будет Биджай Параджули, исследователь из моей лаборатории. Начните с быстрого размораживания замороженных индуцированных плюрипотентных клеток микроглии человека, полученных из стволовых клеток, на водяной бане с температурой 37 градусов цельсия. Вращайте образцы до тех пор, пока весь видимый лед не растает.

Добавьте размороженный iPSMG в культуральную среду, прогретую до 37 градусов цельсия. Добавьте один миллилитр клеток к 10 миллилитрам культуральной среды. Центрифугируйте клетки в 300 раз г в течение пяти минут для получения ячейки гранулы.

Удалите супернатант, не нарушая гранулу клетки. Добавьте трансплантационную среду для получения клеточной концентрации от 10 до пятой клетки на микролитр. Поместите iPSMG на лед, и сразу же приступайте к пересадке.

Чтобы подготовить мышей к трансназальной трансплантации, кормите самцов мышей диетой, содержащей PLX, в течение семи дней. В конце седьмого дня прекратите диету PLX и кормите мышей нормальным рационом. За час до трансназальной трансплантации iPSMG вводят 2,5 микролитра гиалуронидазы в PBS в каждую ноздрю дважды, используя 10-микролитровый наконечник пипетки для увеличения проницаемости слизистой оболочки носа.

Поместите мышей в положение лежа на спине после применения гиалуронидазы. Вводят 2,5 микролитра гиалуронидазы за десять минут до трансназальной трансплантации iPSMG. Нанесите 2,5 микролитра клеточной суспензии в одну ноздрю мыши с помощью 10-микролитрового наконечника пипетки.

Поместите мышь в положение лежа на спине в течение пяти минут перед введением клеточной суспензии в другую ноздрю. Вводят клеточную суспензию четыре раза, применяя общий объем 20 микролитров на животное. Через 48 часов после прекращения кормления PLX повторяют введение гиалуронидазы и клеточной суспензии тем же мышам.

Для введения цитокинов нанесите 2,5 микролитра трансплантационной среды в одну ноздрю мыши с помощью 10-микролитрового наконечника пипетки. После двух месяцев трансназальной трансплантации количество трансплантированных клеток может быть определено путем подсчета клеток, которые являются положительными как для специфических для человека, так и для панмикроглиальных маркеров. Эндогенная микроглия мыши положительна только для панмикроглиального маркера.

У контрольных мышей была обнаружена только мышиная микроглия как в коре, так и в гиппокампе. В коре трансплантированных мышей iPSMG были обнаружены только мышиные микроглии, тогда как в гиппокампе были обнаружены iPSMG. При попытке этого протокола полное удаление супернатанта имеет важное значение для предотвращения разбавления цитокинов.

Крайне важно применять цитокин каждые 12 часов для жизнеспособности трансплантированных клеток. Истощение эндогенной мышиной микроглии требуется для трансплантации iPSMG. Эта процедура позволяет трансплантировать iPSMG в нормальный или больной мозг мыши.

Таким образом, можно определить характеристику iPSMG, а также реакцию на заболевание. Этот метод подходит для определения in vivo характеристики iPSMG в мозге мыши. Таким образом, трансплантация iPSMG мышам модели заболевания поможет нам понять ответ и может проложить путь к новой терапевтической цели.