В связи с растущим интересом к клеточной терапии необходимы новые методы оценки функциональности этих клеток. Этот протокол позволяет in vitro проводить долгосрочную оценку приживления этих клеток в нейронном контексте. Основные преимущества этой методики в том, что все компоненты имеют человеческое происхождение.
Кроме того, приживление может быть легко отслежено, а среда из органоида может быть легко изменена, что позволяет тестировать различные препараты или виды лечения. Эту технику продемонстрирует Илиана Ибаньес, талантливый аспирант из моей лаборатории. Начните с удаления одноклеточной суспензии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или полученных из ИПСК нейральных клеток-предшественников (NPC) изо льда и центрифугирования их при 300 г в течение пяти минут при температуре 4 градуса Цельсия.
Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в дозе 3 миллиграмма на миллилитр солюбилизированного матрицы базальной мембраны, чтобы получить окончательный объем в два микролитра на инъекцию. Немедленно положите суспензию обратно на лед до использования. Переложите предварительно охлажденный шприц из морозильной камеры с температурой 20 градусов Цельсия в ведерко со льдом для дальнейшего использования.
Далее извлеките органоидную пластину мозга из инкубатора и перенесите органоид в 35-миллиметровую чашку, используя наконечник с широким отверстием. Чтобы стабилизировать органоиды и облегчить инъекцию, удалите среду настолько, насколько это возможно, не повредив органоид. Поместите 35-миллиметровую чашку с органоидом под препарирующий микроскоп, чтобы облегчить инъекцию.
После того, как органоиды будут готовы к введению, осторожно ресуспендируйте NPC-клетки, помеченные EGFP, с помощью охлажденного наконечника пипетки P20 и переместите два микролитра этих клеток на предварительно охлажденный стерильный предметной стекол. Возьмите со льда предварительно заполненный инсулиновый шприц и медленно наберите 2 микролитра клеточной суспензии скосом иглы вниз. Откройте крышку чашки, содержащей органоид, прежде чем сфокусировать на нем микроскоп.
Придерживая блюдо одной рукой, поставьте скос иглы вверх. А другой рукой медленно вводите клетку в поверхность органоида. После введения клеток поместите крышку обратно в чашку и инкубируйте введенный органоид в течение одной-двух минут.
Затем осторожно добавьте 500 микролитров органоидной среды в планшет, прежде чем переложить органоид в 24-луночный планшет с широким отверстием. Инкубируют органоид при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа с полной сменой среды через день. Загрузите неинжектированный или отрицательный контрольный органоид во флуоресцентный микроскоп.
Установите интенсивность освещения от 1 до 2 и время экспозиции от 80 до 100 миллисекунд для минимальной автофлуоресценции. Затем загрузите органоид положительного контроля и увеличьте время экспозиции, чтобы убедиться, что меченые клетки видны. Переместите органоид с помощью наконечника пипетки с широким отверстием, чтобы найти улучшенный зеленый флуоресцентный белок или область EGFP plus для инъекции.
Полностью удалите среду из органоида перед загрузкой органоида. И изобразите его с выбранными настройками. Как только визуализация будет завершена, немедленно добавьте свежую среду, чтобы предотвратить высыхание органоида.
После повторного удаления среды и визуализации для всех органоидов верните органоиды в нормальное состояние инкубации и смену среды. Повторяйте визуализацию через желаемые промежутки времени. Поместите предметное стекло в банку для окрашивания предметных стекол Coplin, наполненную толуолом, на две минуты и повторите этот шаг.
Затем перенесите предметное стекло в стеклянную банку для окрашивания предметных стекол Coplin, наполненную 100% этиловым спиртом, на две минуты. И повторите этот шаг, прежде чем переложить предметное стекло в банку Коплина, наполненную водой, на две минуты. Повторите стирку водой.
Затем поместите пластиковый контейнер на водяную баню, следя за тем, чтобы пластик не касался дна ванны. Залейте цитратный буфер внутрь пластикового контейнера и дайте ему нагреться от 95 до 100 градусов по Цельсию. Как только буфер достигнет желаемой температуры, поместите предметные стекла внутрь буфера и неплотно накройте контейнер крышкой, оставив предметные стекла на водяной бане на 30-40 минут.
После инкубации снимите пластиковую емкость с водяной бани и дайте ей остыть при комнатной температуре в течение 20 минут. Вымойте предметные стекла три раза по две минуты каждый с помощью PBS. Удалите PBS бумажной салфеткой, не прикасаясь к образцу.
Приготовьте буфер для пермеабилизации и наполните им банку для окрашивания предметных стекол. Погрузите предметные стекла в буфер проницаемости и инкубируйте в течение 10 минут. Повторите три смывания PBS в течение двух минут каждая.
Затем приготовьте смесь для окрашивания, чтобы покрыть каждый образец, и добавьте 25 микролитров в предметное стекло органоида, прежде чем инкубировать предметное стекло при комнатной температуре в течение одного часа. После инкубации повторите три промывки PBS в течение двух минут каждая и удалите соли, промыв предметное стекло дистиллированной водой внутри банки для окрашивания предметных стекол. Затем добавьте 10 микролитров жидкостных креплений и DAPI в каждый образец, прежде чем визуализировать предметное стекло с помощью флуоресцентного микроскопа.
В стеклянную банку для окрашивания Coplin, наполовину заполненную буфером для закалки 2X, добавьте 45 миллилитров PBS и поместите предметные стекла внутрь этой банки. Выдержите банку в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия. Используйте флуоресцентную микроскопию, чтобы проверить, были ли флуорофоры эффективно погашены, прежде чем повторять окрашивание и визуализацию.
Явная зависимость флуоресценции GFP от количества входных клеток присутствовала с последовательным обнаружением EGFP плюс клеточное пятно на 10 000 клеток и выше. Инъецированные органоиды и контрольная группа, визуализированные для положительного результата EGFP, показали персистенцию места инъекции в течение четырехмесячного периода отслеживания. Дополнительные EGFP-положительные клеточные участки появились через девять дней после трансплантации и сохранялись до конечной точки исследования, что указывает на миграцию клеток и интеграцию в их новых местах.
При большем увеличении наблюдалась четкая морфология нейронов с длинными выступами в органоид, что подтверждало интеграцию введенных клеток. Первоначальное окрашивание подтвердило наличие EGFP плюс клеток в месте инъекции, включая смесь клеток, сохраняющих статус NPC, и тех, которые дифференцировались в сторону нервной судьбы. Для контрольных и инъецированных органоидов наблюдалось очень мало Nestin плюс NPC, с большинством TUJ1 плюс незрелые зрелые нейроны.
Два круглых окрашивания дали больше деталей, выявив зрелые нейроны вокруг большей части внешней области органоида, с участками незрелых нейронов ближе к середине. Астроциты присутствовали в инъецированных и контрольных органоидах и располагались вкраплениями по внешним краям. Срез, для которого было выполнено двухраундовое окрашивание во введенном органоиде, показал небольшую колонию-сателлит EGFP плюс клетки, расположенные далеко от места инъекции, которые приняли фенотип зрелых нейронов.
Некоторые из этих колоний, по-видимому, находятся рядом с астроцитами. Тем не менее, ни одна клетка EGFP plus с полным перекрытием окрашивания GFP не показала, что они были рядом, а не генерировали сами астроциты. Когда вы вводите органоид, вы должны избегать приложения слишком большой силы или делать это слишком быстро, так как вы можете полностью разрушить органоид.
Таким образом, после отслеживания жизни органоиды могут быть ассоциированы и использованы для анализа проточной цитометрии или секвенирования отдельных клеток. Это позволит нам узнать молекулярное состояние клеток. Этот метод может быть чрезвычайно полезен для развития клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний, а также для моделирования опухолей или метастазов головного мозга.
