Этот подход позволяет исследовать клеточную идентичность, интеграцию и функциональность трансплантированных интернейронов в течение длительного времени в развитии здорового и больного мозга. Протокол описывает быструю и высокоэффективную генерацию ГАМКергических интернейронов, полученных из стволовых клеток человека, таких как предшественники, которые выживают и созревают в гиппокампе наивных и трансгенных мышей. Этот подход помогает нам оценить терапевтический потенциал использования клеточной терапии при нарушениях развития, где интернейроны скомпрометированы.
Для начала удалите среду культивирования клеток из предшественников интернейрона человеческого происхождения и тщательно промойте DPBS без кальция и магния. Добавьте 400 микролитров раствора для отсоединения клеток в каждую лунку шестилуночной пластины. Инкубируйте в течение двух-трех минут при 37 градусах Цельсия в инкубаторе, пока граница клеток не начнет выглядеть блестящей.
Затем добавляют 600 микролитров свежей среды N2 в каждую лунку шестилуночной пластины, чтобы остановить раствор для отсоединения клеток, и механически отделяют ячейки с помощью пипетки для получения одноэлектрической суспензии. Переложите клеточную суспензию в пластиковую трубку и центрифугу при 180 Г в течение четырех минут при комнатной температуре. Выбросьте супернатант с помощью вакуумной системы и повторно суспендируйте гранулу в среде для трансплантации.
Подсчитайте общее количество ячеек в суспензии с помощью счетной камеры и счетчика и отрегулируйте объем до конечной концентрации 100 000 клеток на микролитр. Держите клеточную суспензию в закрытой трубке на льду до трансплантации максимум четыре часа. Сразу после анестезии поместите щенка на влажную ткань на поверхности влажного льда на три минуты, пока верхние конечности не станут беловатыми.
Осторожно повторно суспендируйте клетки пипеткой и загрузите шприц клеточной суспензией. Расположите щенка, поместив его на стереотаксическую рамку и используя ушные вкладыши в противоположном направлении. Далее очистите поверхность кожи с помощью мягких тканей, пропитанных этанолом.
Определите лямбду и установите координаты равными нулю на консоли цифрового дисплея стереотаксического инструмента. После перемещения шприца Гамильтона к нужным координатам используйте 90-градусную изогнутую инсулиновую иглу, чтобы проникнуть в череп, создав крошечное отверстие. Затем опустите шприц Гамильтона вниз до тех пор, пока игла не пересечет череп и не обнулите координату дорсовентрального нерва.
Опустите иглу до тех пор, пока не будут достигнуты желаемые дорсовентральные координаты. Медленно втягивайте иглу после введения стволовых клеток. Завершите процедуру, разогревая щенка руками, пока он не начнет двигаться, прежде чем отдать его обратно матери.
Иммунная реакция или местное воспаление против трансплантированных клеток не были обнаружены ни на 14-й день, ни на два месяца после трансплантации, что оценивалось по отсутствию реактивной микроглии, идентифицированной с использованием Iba1, CD68 и галектина-3. Степень астроглиоза определяется глиальным фибриллярным кислым белком и воспалительными цитокинами, такими как интерлейкин-1, и отсутствием цитотоксических лимфоцитов. У нокаутированных мышей Cntnap2 интернейроноподобные клетки, полученные из стволовых клеток человека, выживали до девяти месяцев после трансплантации и были локализованы в месте инъекции.
Хотя они также были рассеяны по ипсилатеральному и даже контралатеральному гиппокампу, как это наблюдалось у мышей дикого типа. Протокол требует практики, чтобы обеспечить минимальное нарушение и сжатие мозга, а также сохранить хороший баланс между скоростью процедуры и точностью координат. Этот протокол совместим с целым рядом методов, таких как исследования связности или функциональные показания, такие как электрофизиология или поведенческие исследования, в зависимости от вашего исследования, представляющий интерес.
