Как мы уже знаем, микроокнония опухоли является неотъемлемой частью роста и вторжения рака. Чтобы имитировать прогрессирование карциномы, нам нужна биологически соответствующая матрица опухоли человека. Это единственная матрица опухоли человека, основанная на анализе вторжения в пробирку.
По сравнению с классическим сфероидным анализом, этот метод не так чувствителен к температуре и не требует передачи сфероидов. Этот метод подходит для пациентов, полученных твердых образцов рака, таких как голова и шея карциномы и может распространяется на персонализированную медицину, включая химиорадиации терапии. Эта человеческая матрица на основе опухоли уже используется для нескольких применений, включая высокой пропускной способности тестирования на наркотики, анализ живых клеток, заживление ран, и передачи анализов.
Наиболее технически чувствительным шагом является обработка метода фибриногена добавляется так что вы можете сначала практиковать этот шаг с пустыми скважинами. Важно, чтобы показать правильную обработку матрицы, и это легко анализировать, показывая метод визуально. Для многоклеточной генерации сфероидов опухоли, обойтись один раз 10 до третьих клеток из клеточной линии интереса в 50 микролитров полной среды в каждый колодец 96-ну ультра-низкой крепления круглой нижней пластины.
Затем поместите пластину в 37 градусов по Цельсию и 5%углекислый газ клеточной культуры инкубатор в течение четырех дней, прежде чем визуально подтвердить образование опухоли сфероидов с перевернутым микроскопом. Чтобы создать трехмерный анализ вторжения сфероидов, оттепель человека миомы полученных матрицы на льду и оттепели фибриногена фондового раствора в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Когда реагенты нагреваются, смешать соответствующие объемы полной среды, человека миомы полученных матрицы, тромбина, апротинина и фибриногена, добавив фибриноген незадолго до дозирования матричной смеси в клетки.
Немедленно добавьте 50 микролитров полученного геля в каждый колодец пластины сфероидной культуры, направляя кончик к внутренней стене каждой хорошо и трубя замедление, не перемещая сфероид из центра хорошо. Так как фибриноген начинает гель через несколько минут, он требует надежной, но точной обратной трубы и обработки только несколько скважин за один раз. Вернуть пластину в инкубатор клеточной культуры в течение 30 минут, чтобы позволить человеку миомы полученных матричных фибринов гель затвердеть, прежде чем аккуратно добавить 100 микролитров полной среды в верхней части каждого геля.
Затем ежедневно изображение фероидного вторжения. Для сегментации изображений с помощью ilastik откройте программное обеспечение для классификации и сегментации изображений с открытым исходным кодом и выберите рабочий процесс классификации пикселей. Сохраните проект ilastik на компьютере.
Пиксели будут классифицированы на основе аннотаций, сделанных пользователем. Нажмите Входные данные и добавить новые, чтобы выбрать изображения для анализа. Для выбора функций нажмите Наберите функции и выберите функции.
Нажмите соответствующие коробки, чтобы выбрать особенности, представляющие интерес. Выбранные коробки позеленуют. Для обучения нажмите Обучение.
В разделе Обучение должно быть две метки: Label 1 и Label 2. Отметь фон одной из меток и отметь ячейки другой этикеткой. Когда все ячейки и фон в первом изображении были помечены, выберите следующее изображение из текущего представления, чтобы продолжать отмечать ячейки и фон до тех пор, пока 10% изображений не будут помечены.
Затем выберите Live Update для анализа всех изображений. Когда обучение было завершено и ilastik проанализировал все изображения, нажмите Прогноз экспорта и выберите простой сегментации из источника. Затем выберите желаемый формат файла вывода из настроек изображения Select Export Image и нажмите Export All, чтобы экспортировать результаты маркировки.
Файлы будут экспортироваться в ту же папку с исходными изображениями. Для анализа области, сначала откройте исходное изображение с баром масштаба в Fiji ImageJ, заботясь о том, чтобы изображение имеет тот же размер и размер, что и проанализированные изображения. Используйте инструмент выбора строки, чтобы нарисовать линию известной длины и нажмите Анализ и Установить шкалу.
Затем установите известное расстояние в известном дистанционном поле. Установите соответствующий блок и нажмите Global. Чтобы установить плагин ilastik, нажмите Справка и обновление и нажмите Управление обновления сайтов в окне обновления ImageJ.
Нажмите рядом с ilastik, Закройте и примените изменения. Через несколько минут появится информационное окно, которое будет успешно обновляться. Нажмите OK и перезапустите ImageJ.
Далее нажмите Плагины, Макрос, и установить и выбрать счетчик. ijm файл. Затем нажмите Open.
Чтобы завершить анализ области, нажмите Plugins и прокрутите, чтобы выбрать ilastik. Выберите Import HDF5 и выберите файл в формате h5. Нажмите Открыть и загрузить и применить таблицу осмотра.
Затем нажмите кнопку A на клавиатуре, и область появится в сводном окне в качестве общей площади. В этом репрезентативном эксперименте, через четыре дня после метастатического ларингального плоскоклеточного карциномы линии посева, матрица была добавлена на сформированные сфероиды, как попродемонстрировано, и вторжение отслеживалось ежедневно на перевернутом микроскопе. После встраив, клетки в человека миомы полученных фибрина матрицы начали быстро вторгаться после одного дня и распространяется в матрицу в течение ближайших двух дней.
Клетки в матрице саркомы мыши не вторгались в окружающую матрицу, вместо этого образуя асимметричную структуру. Клетки коллагена вторглись немного, но из-за усадки матрицы анализ стал трудным. В некоторых скважинах сфероиды даже исчезли через три дня.
Здесь показана количественная оценка вторжения первичной и метастатической ларингальной плоскоклеточной карциномной клетки в матрице фибрина, полученной из миомы человека. Анализ живых клеток человека миомы полученных фибринов матрицы сфероида вторжения показывает движение клеток в прядях по всей матрице, которая следует другие клетки с течением времени. Помните, чтобы быть осторожным, чтобы не переместить сфероид из положения центра при добавлении матрицы к скважинам.
Эта процедура может быть использована для изучения того, как облучение и конкретные молекулы, такие как раковые препараты влияют на вторжение. Клетки могут быть исправлены и окрашены для последующих исследований. В классической модели саркомы мыши клетки в основном размножаются, а аспект вторжения минимален.
Эта человеческая матрица на основе опухоли вызывает вторжение, делая исследования ингибирования более эффективными.
