Этот протокол массовой цитометрии сохраняет целостность всего костного мозга, позволяя спасти информацию, которая была утеряна при обычной подготовке образца для анализа изученных клеток. Этот быстрый и легкий протокол изоляции костного мозга облегчает приобретение жизнеспособных недолговечных популяций миелоидных клеток, таких как редкие подмножества нейтрофиловой линии. Использование массовой цитометрии для выявления ранее оцененных иммунных клеток, таких как нейтрофиловые клетки, может иметь широкие последствия для широкого спектра заболеваний.
Этот протокол сохраняет целостность недолговечных миелоидных клеток, которые присутствуют в костном мозге и могут быть легко применены к другим типам тканей, таких как твердая опухоль. Мы упростили протокол, чтобы сделать его максимально удобным для пользователей, но, как и во всех биологических исследованиях, для управления им может потребоваться несколько практических запусков. Когда вы делаете это в первый раз, вы можете получить все ваши реагенты готовы, а затем строго следовать протоколу.
Если у вас возникли какие-либо проблемы, вы можете подключиться к CyTOForum и поговорить с другими пользователями CyTOF, которые могут помочь в устранении неполадок. Для подготовки биологического образца, простые трюки могут иметь огромное значение с конечный результат. Визуальная демонстрация гораздо проще для нового пользователя, чтобы понять протокол.
Если вы делаете это в первый раз, вы можете получить ваши реагенты готовы, а затем строго следовать протоколу. Для сбора костного мозга, место от шести до 10 недель C57 черный шесть мыши в положении на спине на стерильной хирургической площадке и использовать 70% этанола для стерилизации живота и задних конечностей. Используйте пару вскрытия хирургических ножниц, чтобы открыть брюшную полость и удалить кожу, чтобы разоблачить задние конечности.
Используя пару тупых наконечником вязки одевания, удерживайте голени мыши прямо под лодыжкой и использовать пару изогнутых вязок одевания для стабилизации голени ниже тупой наконечником вязки одевания. Используйте тупой наконечником одевания миппы сломать голени и удалить мышцы подвергать кости. Перед размещением голени в холодном PBS, переместить стабилизирующую изогнутую повязку миппы на бедренную кость и слайд тупой наконечником вязания типсов ниже коленного сустава, чтобы держать коленную чашечку.
Аккуратно подтяните, чтобы вывихнуть коленную чашечку и удалить мышцу из коленной чашечки, чтобы разоблачить бедренную кость. Держите открытые бедренной кости изогнутые вязки одевания и использовать хирургические ножницы, чтобы сократить бедренной кости от нижней части кости. Затем поместите бедренную кость в PBS.
Затем используйте 18 калибровочной иглы, чтобы пробить отверстие в 0,5 миллилитров микро центрифуги трубки и место обеих костей в трубку с открытыми концами костей лицом вниз в отверстие. Поместите 0,5 миллилитровую трубку в 1,7 миллилитровую микро центрифугу и вращаем двухслойные трубки в микро центрифуге. В конце центрифугации, подтвердите, что костный мозг был извлечен на дно трубки.
Чтобы испачкать клетки костного мозга для массовой цитометрии, повторно приостановить костный мозг в один миллилитр буфера лиза красных кровяных телец в течение 10 минут при комнатной температуре. В конце инкубации, собирать клетки центрифугации и повторно приостановить гранулы в один миллилитр холодного PBS. Фильтр клетки через 70 микрометровый ситечко в 15 миллилитров конической трубки и мыть клетки с девятью миллилитров свежих, холодных PBS.
Повторно приостановить гранулы клеток костного мозга в 10 миллилитров свежих, холодных PBS для подсчета и передачи пять раз 10 в шестой клеточной aliquot в новую 15 миллилитровую трубку. Соберите клетки путем центрифугации и повторно приостановить клетки в один миллилитр массы цитометрии окрашивания буфера, дополненный 125 наномолярных цисплатин. Через пять минут при комнатной температуре промыть клетки в четыре миллилитра свежей массы цитометрии буфера.
Повторно приостанавливайте гранулы в 50 микролитров блокирующего раствора рецепторов FC. Через 10 минут при четырех градусах по Цельсию добавьте 50 микролитров коктейля антител, представляющих интерес для клеток, и аккуратно перемешайте. Температура в различных инкубационых шагов очень важны для сохранения жизнеспособности клеток костного мозга.
После 30 минут при четырех градусах по Цельсию, мыть клетки два раза в два миллилитра свежей массы цитометрии буфера на стирку, прежде чем повторно приостановить клетки в один миллилитр свежеприготовленных 1,6%формальдегида в течение 15 минут при комнатной температуре. В конце инкубации, собирать клетки центрифугации и повторно приостановить гранулы в один миллилитр фиксированного буфера завивки дополнен 125 наномолярных интеркаляции раствор для ночной инкубации при четырех градусах по Цельсию. Перед анализом клеток по массовой цитометрии, аккуратно вихрь и центрифуга клеточной суспензии перед мытьем клеток в два миллилитров свежей массы цитометрии окрашивания буфера.
Далее, мыть клетки два раза в один миллилитр дистиллированной воды на стирку, тщательно аспирации супернатант после второй стирки перед повторной приостановки клеток в один раз от 10 до шестой клетки на миллилитр массы цитометрии буферной концентрации для массового анализа цитометрии. В этом T распределенных стохастических соседа встраивания участка, клетки через несколько тканей мыши были сгруппированы в подмножества на основе сходства их поверхности маркера выражения профилей, как измеряется 33 параметра массы цитометрии панели. Клетки с более похожими свойствами автоматически группируются на основе выражения этих маркеров на каждой ячейке.
Используя этот метод, целостность всего костного мозга была сохранена, что привело к открытию ранее неизвестной популяции клеток, которая одновременно совместно выражает нейтрофил и гематопоэтические стволовые и прародительные клетки подписи поверхностных маркеров. Эта популяция клеток, которая ранее была опущена в исследованиях миелоидных прародителя, из-за положительного истощения клеток Ly6G, демонстрирует четкую картину выражения поверхностного маркера. Что еще более важно, эти данные привели к открытию небольшого подмножества положительного клеточного кластера Ly6G, который не выражает Ly6G, но был сгруппирован близко к CD117 положительные положительные клетки Ly6G, предполагая сходство этих клеток с нейтрофиловой линии на основе выражения 33 поверхностных маркеров, используемых в этом эксперименте массы цитометрии.
13 цвет florescence активированной панели сортировки клеток может быть построен, что позволяет изоляции нейтрофила прародителей потока цитометрии для вниз по течению функциональных анализов. Важно выполнить процедуру изоляции костного мозга как можно быстрее и держать клетки на четыре градуса цельсия во время процедуры окрашивания.
