Вскрытие сетчатки мыши является очень деликатный процесс из-за размера и формы глаз и хрупкость сетчатки. Императив на практике, имея подробный протокол, который обеспечивает эффективный метод и советы является ключом к высокому качеству вскрытия сетчатки и раздела. Мы предоставляем советы и рекомендации, чтобы помочь исследователю избежать общей ловушки и получить некоторые высококачественные секции сетчатки подходит для иммуногистохимии.
Отметите височную часть глаза усыпанной мыши с помощью хвостового прижигателя, касаясь роговицы очень легко и не более чем на долю секунды, чтобы слегка сжечь роговицу и избежать отверстия. Сразу после этого используется изогнутый Дюмон 545 типсов, чтобы окутать глаза мыши. Поместите глаза в криотрубу 1,5 миллилитров с одним миллилитром 4%PFA и PBS и инкубировать в течение 15 минут на льду.
Затем перенесите фиксированные глаза с помощью изогнутых типсов Dumont 545 в модифицированное 35-миллиметровое рассечение, наполненное PBS, и поместите под рассечение микроскопа. Используйте микронойф, чтобы сделать небольшой разрез на ожог знак перпендикулярно и чуть выше границы лимбуса роговицы. Вставьте изогнутые ножницы в разрез и выполните окружной разрез роговицы после лимбуса.
Затем, используя тонкие Dumont 5 типсов, удалить роговицу, извлечь объектив, и поднять его деликатно от задней части глаза. Стекловидное тело выйдет с объективом и сетчатка будет видна как белая поверхность, покрывающая внутреннюю часть задней чашки глаза. Вымойте изолированные чашки глаз дважды в одном миллилитре PBS в течение 10 минут при комнатной температуре.
Для крио-защиты глаз чашки, equilibrate их в 15% сахарозы и PBS ночь на четыре градуса по Цельсию, пока они не утонут. Затем перенесите чашки глаз на 30% сахарозы и PBS в течение двух-трех часов, пока они не утонут. Поместите чашки для глаз в OCT в 10 на 10 миллиметров крио-формы для встраивания.
Под рассечением микроскопа, сориентировать глаз в крио-формы вдоль спинной брюшной оси, вращая глаз, пока ожог знак находится на вершине. Зрительный нерв является одним слева и вырезать часть формы лица вправо. Чтобы заморозить ткани сетчатки, погрузите крио-плесень, по крайней мере пять минут в металлический стакан, содержащий изопентан, а затем поместите стакан в жидкий азот до одной трети высоты стакана.
Снимите замороженный блок, заверните его в алюминиевую фольгу и храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Используйте ручку или Sharpie, чтобы отметить замороженный блок, чтобы записать его ориентацию. После корректировки температуры криостата между минус 20 и минус 25 градусов по Цельсию, поместите формы, содержащие встроенные чашки для глаз внутри и дайте им уравночные до температуры криостата в течение одного часа.
Установите блок в криостате с спинной брюшной ориентацией и начните резать серийные секции толщиной 10 микрометров. Аккуратно поместите секции сетчатки на аннотированные и проумереные слайды микроскопа, а затем храните в слайд-боксах при температуре минус 20 градусов по Цельсию или минус 80 градусов по Цельсию до готовности к иммуностимулятору. Иммуногистохимия с антителами к родопсину, маркер фоторецептора, декарбоксилаза глутамной кислоты 65, маркер клеток амакрин, глутамин синтетазы и маркера клеток Мюллера, а также кальбиндин, горизонтальный маркер клеток был выполнен на секциях сетчатки.
Результаты показывают, что этот протокол дает высокое качество и хорошо сохранившиеся секции сетчатки в отличие от низкого качества секций сетчатки, полученных из другого протокола. Богатые родопсином внутренние и внешние сегменты остаются вертикальными и нетронутыми практически без отделения от чрезмерного пигмента сетчатки эпителия. Интернейроны, такие как положительные амакринные клетки Gad65, остаются должным образом стратифицированными внутри внутреннего ядерного слоя и внутреннего плексиформного слоя.
Кроме того, клетки Мюллера остаются хорошо сохранившимися с сомой, правильно выровненной в цитоплазмических процессах, которые охватывают от слоя ганглионных клеток до внешнего ядерного слоя. Кроме того, четко определенные горизонтальные ячейки обнаруживаются на внутреннем ядерном слое и внешней границе плексиформного слоя. Важно, чтобы отметить топпер области глаз и сохранить ориентацию во время встраивания.
Всегда подготовь параформалде под капотом с соответствующим защитным оборудованием.
