تشريح الشبكية الماوس هو عملية حساسة حقا نظرا لحجم وشكل العينين وهشاشة قسم الشبكية. ضرورة الممارسة، وجود بروتوكول مفصل التي توفر طريقة فعالة ونصائح هو المفتاح لتشريح شبكية العين عالية الجودة والقسم. نحن نقدم نصائح ونصائح لمساعدة الباحث على تجنب المزالق المشتركة والحصول على بعض أقسام شبكية العين عالية الجودة مناسبة للكيمياء المناعية.
وضع علامة على الجزء الزمني من عين فأر القتل الرحيم باستخدام الكي الذيل عن طريق لمس القرنية بخفة ولا تزيد عن جزء من الثانية لحرق القرنية قليلا وتجنب إحداث ثقب. مباشرة بعد أن استخدم المنحني دومون 545 ملقط لـ enucleate عيون الماوس. ضع العينين في 1.5 ملليلتر على 1 ملم مع ملليلتر واحد من 4٪ PFA و PBS واحتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد.
ثم، نقل العينين ثابتة باستخدام ملقط 545 دوبون المنحنية إلى تعديل 35 ملليمتر تشريح طبق مليئة PBS ومكان تحت المجهر تشريح. استخدام microknife لجعل شق صغير في علامة الحرق عمودي على وفوق الحدود المتلخوة للقرنية. إدراج مقص منحني في شق وتنفيذ قطع ظرفي من القرنية التالية limbus.
ثم، باستخدام رقيقة دومون 5 ملقط، وإزالة القرنية، واستخراج العدسة، ورفعه بدقة بعيدا عن الجزء الخلفي من العين. سيخرج الجسم الزجاجي بالعدسة وستكون الشبكية مرئية كسطح أبيض يغطي داخل كأس العين الخلفية. اغسلي أكواب العين المعزولة مرتين في ملليلتر واحد من PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
لحماية أكواب العين، وايكوليبيلات لهم في 15٪ السكروز وبرنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية حتى أنها تغرق. ثم نقل أكواب العين إلى 30٪ السكروز وبرنامج تلفزيوني لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات حتى تغرق. ضع أكواب العين في OCT في 10 من 10 ملليمتر قوالب كريو لتضمينها.
تحت مجهر تشريح، وتوجيه العين في قالب التبريد على طول محوره البطني الظهري عن طريق تدوير العين حتى علامة الحرق على القمة. العصب البصري هو واحد من اليسار وقطع جزء من القالب يواجه الحق. لتجميد نسيج الشبكية، غمر قالب البرد لمدة خمس دقائق على الأقل في كوب معدني يحتوي على إيسوبنتان ثم ضع الأكفر في النيتروجين السائل حتى ثلث ارتفاع الأكواب.
إزالة كتلة المجمدة، والتفاف عليه في رقائق الألومنيوم، وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. استخدم القلم أو Sharpie لوضع علامة على الكتلة المجمدة لتسجيل اتجاهها. بعد ضبط درجة حرارة التبريد بين ناقص 20 وناقص 25 درجة مئوية، ضع القوالب التي تحتوي على أكواب العين المدمجة داخل وتسمح لهم بتسوية درجة حرارة التبريد لمدة ساعة واحدة.
تثبيت كتلة في cryostat مع الاتجاه البطني الظهرية والبدء في قطع 10 ميكرومتر سميكة المقاطع المسلسل. ضع أقسام الشبكية بعناية على شرائح المجهر المشروحة والمرقمة ثم قم بتخزينها في صناديق الشرائح عند ناقص 20 درجة مئوية أو ناقص 80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمناعة. الكيمياء المناعية مع الأجسام المضادة لرودودبسين، علامة مستقبلات ضوئية، حمض الجلوتاميك ديكاربوكسيلاز 65، وعلامة خلية الأكاكرين، وغلوتامين سينفتاز وعلامة خلية مولر، وcalbindin، تم تنفيذ علامة الخلية الأفقية على أقسام الشبكية.
وتشير النتائج إلى أن هذا البروتوكول ينتج عالية الجودة والحفاظ على أقسام شبكية العين بشكل جيد على عكس في أقسام شبكية العين ذات نوعية رديئة التي تم الحصول عليها من بروتوكول مختلف. 4- وتبقى الشرائح الداخلية والخارجية الغنية من الرودوبسين عمودية وسليمة مع القليل من الانفصال عن الظهارة المصطبغة في شبكية العين. وتبقى الـ Interneurons، مثل خلايا amacrine الإيجابية Gad65، طبقية بشكل صحيح داخل الطبقة النووية الداخلية وطبقة شبكية داخلية.
أيضا، خلايا مولر تبقى محفوظة بشكل جيد مع سوما الانحياز بشكل صحيح في العمليات السيتوبلازمية التي تمتد من طبقة خلية العقدة إلى الطبقة النووية الخارجية. وعلاوة على ذلك، يمكن الكشف عن الخلايا الأفقية المحددة جيداً في الطبقة النووية الداخلية وحدود الطبقة الضبيقية الخارجية. من المهم وضع علامة على منطقة الـ topper للعيون والحفاظ على التوجه أثناء التضمين.
دائماً إعداد شبهformaldehyde تحت غطاء محرك السيارة مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
