Этот протокол позволяет нам ответить на различные вопросы о том, как стрижка действует на клетки в растворе и обеспечивает значительный контроль над длительностью и величиной стрижки. В отличие от других методов, которые обнаруживают влияние стрижки на клетки, которые обездвижены, этот метод позволяет нам применять снооблочные клетки в растворе и поддается спектру методов обнаружения сигналов ниже по течению. После получения периферической крови от согласия, здоровый взрослый донор в 4,5-миллилитровой трубке 3,8%trisodium цитрат, центрифуга крови, чтобы получить богатые тромбоцитами плазмы, и использовать пипетку кончик вырезать под углом 45 градусов, чтобы тщательно удалить в результате чего верхней, облачной, желтой тромбоцитов богатых плазменный слой.
Получить количество тромбоцитов через полный анализ крови, и настроить количество тромбоцитов примерно в 2,5 раза от 10 до пятого тромбоцитов на микролитер с бассейном человека тромбоцитов бедных плазмы. Затем поместите подвеску на 22 градуса цельсия с нежным вращением. Для лечения лиганда, медленно добавить антитела или лиганд интереса к тромбоцитов богатых плазмы, и смешать тромбоциты мягко.
Во время инкубации включите конусообразный вискометр и установите температуру пластины до 22 градусов по Цельсию. Через 5-10 минут перенесите обработанную плазму, богатую тромбоцитами, на контролируемый температурой конусообразный вискометр непосредственно в центре пластины, заботясь о том, чтобы весь образец был отложен между конусом и пластиной в точке соприкосновения. Чтобы применить сноф к образцу, вычислите сноф в соответствии с руководством по вискометровому анализу и примените ее к образцу с соответствующей скоростью и продолжительностью.
В конце применения, поднимите конус около двух миллиметров от пластины, так что образец остается в контакте с пластиной и конусом, и использовать гель-загрузки пипетки отзыв для сбора от пяти до 10 микролитров из центра объема образца. Затем инкубировать прорубь образца с антителами против поверхностных маркеров интерес в течение 20 минут при комнатной температуре, и исправить образцы в 2%paraformaldehyde в течение 20 минут при комнатной температуре. Чтобы проанализировать образцы по цитометрии потока, соберите не менее 20 000 событий для каждого состояния и количественно оцените силу сигнала каждого флуоресцентного маркера, используя значение высоты для интенсивности каждого флюорофора.
Затем используйте отрицательный контроль с бычьим альбумин сыворотки или транспортного средства, чтобы нарисовать ворота, исключая негативный фон флуоресцентных событий, и количественно процент событий внутри ворот для всех экспериментальных условиях. Выражение маркера активации тромбоцитов в ответ на применение силы стрижки не регулируется в зависимости от времени образом. Здесь показаны репрезентативные считывания активации тромбоцитов человека в присутствии двух антител, нацеленных на N-терминальный домен гликопротеина 1b-IX и одно контрольное антитело при стрижке и статических условиях.
Выражение всех трех маркеров активации было значительно увеличено в присутствии сил стрижки и ориентации антител, по сравнению с либо статических условий или в присутствии антител контроля. Примечательно, что лечение антителами с необязаемой силой слишком низко, чтобы вызвать активацию гликопротеина 1b-IX, не вызывает активации тромбоцитов в условиях статической или стрижки. Кроме того, плазма от пациентов иммунной тромбоцитопении, содержащих антитела против гликопротеина 1b-IX вызвать стрижку зависимых реакций в отличие от плазмы от пациентов без гликопротеина 1b-IX ориентации антител.
В дополнение к flowcytometric анализов, клетки, которые подверглись воздействию снопы могут быть также lysed для западной помарки, ELISA, и масс-специальный анализ для определения любых изменений в уровне белка. Как всегда, при использовании крови или человеческих образцов, не забудьте носить надлежащее защитное оборудование и следовать безопасности лаборатории и крови родился патоген руководящих принципов вашего учреждения.
