Целью данного исследования является оценка функции тромбоцитов в физиологических условиях. В частности, мы изучаем функцию тромбоцитов с помощью микрофлюидных устройств и биологических поверхностей. И используя этот подход, мы смогли ответить на вопросы, связанные с дисфункцией тромбоцитов и гемостатической реанимацией для применения в трансфузионной медицине.
Современные анализы функции тромбоцитов часто проверяют способность тромбоцитов к агрегации в ответ на определенный агонист по выбору. Методы обнаружения могут включать светопропускание или электрическое сопротивление, и эти анализы могут использовать технологические образцы и тестироваться в застое. Используя этот микрофлюидный подход для проверки функции тромбоцитов, мы включаем гидродинамику для придания физиологической значимости.
Гидродинамика играет решающую роль в биологических механизмах, участвующих в функции тромбоцитов во время гемостаза. У пациентов с кровотечением мы особенно обеспокоены функцией тромбоцитов и терапевтическими вмешательствами, которые могут усилить эту функцию для достижения лучших результатов. Используя этот подход к тестированию функции тромбоцитов, мы можем отслеживать вклад различных популяций тромбоцитов в эксперимент и найти способ оценки терапевтических вариантов для травм и других кровотечений.
Для начала насыпьте силиконовую эластомерную основу в чашку для взвешивания. Добавьте силиконовый отвердитель в соотношении десять к одному и тщательно перемешайте смесь, чтобы обеспечить правильное сшивание цепей силиконового полимера. Поместите мастер-форму в чашку Петри и равномерно вылейте неотвержденный PDMS на форму.
Затем поместите чашку Петри в вакуумный эксикатор на 30 минут, чтобы удалить пузырьки из смеси. Чтобы закончить отверждение PDMS, поместите форму в духовку, установленную на 70 градусов Цельсия, на 90 минут. После полного отверждения PDMS с помощью бритвенного лезвия или скальпеля вырежьте микрофлюидный слепок.
Пробейте отверстия по краям каналов. Теперь поместите предметное стекло и микрофлюидную отливку травленной стороной вверх в плазменный очиститель. Запустите вакуумный насос и загерметизируйте камеру.
Затем поверните плазменный очиститель в положение Высокий и оставьте настройку в очистителе на 30 секунд. После этого выключите плазменный очиститель и выпустите вакуум. Чтобы связать очищенный от плазмы литой материал и предметное стекло, аккуратно прижмите друг к другу стороны, которые были обращены вверх в плазменном очистителе.
Поместите микрофлюидное устройство в духовку или на горячую плиту при температуре 70 градусов Цельсия на 10 минут, чтобы завершить процесс связывания. Теперь покройте микрофлюидную камеру реагентом для фибриллярного коллагена лошадей первого типа через специальный выход к назначенному входу. Храните устройство в теплом, влажном, закрытом контейнере, чтобы предотвратить испарение коллагена с покрытием внутри канала.
Через час промойте устройство PBS в направлении, противоположном покрытию, чтобы вымыть коллагеновый раствор. Для начала инкубируйте цицитированную цельную кровь с флуоресцентным конъюгированным антителом CD41 с использованием флуорофора по выбору. Окрашивайте кровь в течение 30 минут на качалке.
Далее включите микроскоп и связанное с ним программное обеспечение. Установите уровень насоса шприца с помощью предметного столика микроскопа и отрегулируйте настройки шприцевого насоса в соответствии с экспериментальными требованиями. Затем поместите микрофлюидное устройство на предметный столик микроскопа и прикрепите его края к предметному столику, чтобы предотвратить движение.
Теперь подсоедините трубку внутреннего диаметра в одну шестнадцатую дюйма к коленевому соединителю, а затем к шприцу объемом 10 миллилитров с соединителем внутреннего диаметра в одну шестнадцатую дюйма. Наполните 10-миллилитровый шприц стерильным PBS и подсоедините его к шприцевому насосу. Затем вставьте локтевый соединитель в выходное отверстие микрофлюидного устройства.
Подготовьте приточные трубопроводы длиной примерно 10 сантиметров с коленчатым соединителем на одном конце и угловым вырезом на другом конце. Теперь подсоедините входной соединитель колена к входу устройства и поместите входную линию в трубку для отходов микроцентрифуги, расположенную на угловом держателе. Используйте объектив с 10-кратным увеличением для фокусировки на краях канала микрофлюидного устройства.
Затем загрунтуйте линии с помощью PBS. Вручную продвигайте шприцевой насос, чтобы очистить канал от PDMS или мусора. Проверьте наличие препятствий возле входа и выхода канала.
Теперь откройте сохраненные настройки захвата изображений или создайте новую процедуру захвата изображений временных рядов, полученных каждые одну-две секунды с помощью яркого канала поля и флуоресцентных каналов, соответствующих антителам CD41 в образце крови. Возьмите отфильтрованный образец цитированной крови и смешайте его с помощью пипетирования вверх и вниз непосредственно перед началом эксперимента. Поместите образец на угловой держатель микроцентрифуги.
Затем поместите входную капельницу в образец крови и начните запись изображения. Медленно извлеките шприц, чтобы заполнить мертвый объем в трубке. Как только кровь достигнет канала, немедленно нажмите кнопку воспроизведения на шприцевом насосе, чтобы возобновить поток с желаемой скоростью.
Проводите эксперимент до тех пор, пока тромбоциты полностью не окклюзируют стенотическую область микрофлюидного устройства или до экспериментальной конечной точки, которая обычно составляет 10 минут. После завершения эксперимента остановите захват изображения и остановите работу шприцевого насоса. Наконец, сохраните снимок в соответствующее хранилище.
