В нашем протоколе мы используем регидратацию пленки из маленьких стеклянных бусинок для формирования реакционной отсеки из пептидов. В экспериментах мы извлекаем выгоду из простоты и надежности протокола. Основным преимуществом этого метода является способность включать даже чувствительные образцы, такие как использованная экстракт сырой клетки.
Контакт с органическими растворителями существенно повлияет на образец. Чтобы начать эту процедуру, используйте центробежный вакуумный концентратор, чтобы сконцентрировать раствор ELP до 1,1 миллимолара. Смешайте 200 микролитров этого концентрированного раствора с 1 250 микролитров смеси хлороформа и метанола.
Vortex решение тщательно перемешать. Затем добавьте 1,5 грамма сферических стеклянных бусин в десятимильную круглую нижнюю колбу. Добавьте раствор ELP и хлороформ метанола в круглую нижнюю колбу и аккуратно встряхните, чтобы перемешать.
Соедините колбу с вращающимся испарителем. Отрегулируйте скорость до 150 об/мин и отрегулируйте давление до 20 000 паскалей в течение примерно четырех минут, пока жидкость не испарится при комнатной температуре. Важно быть осторожным при использовании роторного испарителя из-за возможной задержки кипения.
После этого, свободно обернуть алюминиевую фольгу вокруг открытия круглой нижней колбы, чтобы предотвратить потерю стеклянных бусин и поместить колбу в децикатор, по крайней мере один час, чтобы убедиться, что остальные хлороформ и метанол испаряются. Для одного эксперимента смешайте 100 миллиграммов покрытых пептидом стеклянных бусинок с 60 микролитров раствора отеков. Инкубировать этот образец при 25 градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Используйте центрифугу столешного верха, чтобы центрифуга образцов быстро и осадок стеклянные бусы. Затем используйте пипетку для сбора супернатанта, который содержит пузырьки. Во-первых, смешать 100 микролитров предварительно очищенной плазмидной ДНК со 100 микролитров либо роти-фенола, хлороформа, либо изоамилового спирта в микро центрифуге трубки, чтобы лучше разделения фазы.
Аккуратно инвертировать трубку до шести раз и центрифугу при температуре 16 000 г и комнатной температуре в течение пяти минут. Затем добавьте 200 микролитров хлороформа в верхнюю фазу и инвертировать трубку до шести раз. Центрифуга образца в 16 000 раз г и комнатная температура в течение пяти минут.
После этого пипетку супернатант в отдельную трубку и добавить 10 микролитров трех ацетат натрия молара для осадков этанола. Добавьте один миллилитр холодного этанола при 80 градусах по Цельсию и храните образец при 80 градусах Цельсия в течение одного часа. Затем центрифуга образца в 16 000 раз г и четыре градуса цельсия в течение 15 минут.
Декант супернатант и добавить один миллилитр холодного 70%этанола при 20 градусах по Цельсию. Центрифуга при 16 000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Затем удалите жидкость путем пипетки, будьте осторожны, чтобы не беспокоить гранулы ДНК.
Храните образец при комнатной температуре в течение примерно 15 минут, чтобы испарить оставшийся этанол. После этого добавьте в образец ультра чистую воду, чтобы отрегулировать концентрацию образца примерно до 300 наномоляров, которые измеряются абсорбцией на 260 нанометров. Чтобы подготовить транскрипционно-переводную реакцию, следуйте подготовленной добыче сырой клетки и буферу реакции на льду.
Для смеси реакции 60 микролитров добавьте ДНК плазмы в 37,5 микролитров буфера реакции, добавьте 28,7 микролитров экстракта сырой клетки и заполните ультра чистой водой до конечного объема 58,8 микролитров. Прямо перед началом реакции добавьте 1,2 микролитров раствора полимеразы T7RNA и пипетки вверх и вниз, чтобы перемешать. Инкубировать образец и отек раствор при 29 градусах по Цельсию в течение всего эксперимента, который, как правило, от четырех до восьми часов.
Передача электронной микроскопии изображения пузырьков показывают, что различные отек решения, такие как TX / TL или даже только PBS могут быть использованы для формирования пузырьков. Для обоих решений определение размера является прямым шагом вперед. Динамическое рассеяние света показывает, что пузырьки, подготовленные без метода стеклянных бусин, приводят к диаметру 134 нанометров, с полидисперсностью 25%При использовании стеклянных бусин диаметр составляет 168 нанометров, с поликлюперностью 21%Интенсивность флуоресценции двух флуоресцентных белков, которые выражаются внутри пузырьков ELP, затем измеряются с помощью флуоресцентной пластины.
Важно отметить, что после образования пузырьков, содержание пузырьков и внешнего раствора одинаковы, таким образом, антибиотик Канамицин добавляется к внешнему раствору для подавления экспрессии белка. В качестве контроля, Канамицин также добавляется в отек раствор, и в этом случае экспрессия белка внутри везикулы подавляется. Это указывает на то, что Канамицин не рассеивается через мембрану, и подавляет внутреннее выражение постоянно, все время.
Анализ FRET затем выполняется, чтобы продемонстрировать включение ELP в мембрану. При выражении мембранных ELPs, дополнительные пептиды включают в мембрану, что увеличивает среднее расстояние между парами FRET, и что приводит к увеличению донорского сигнала. Представленный метод может быть использован для производства простых контейнеров реакции или для создания искусственных клеток с пептидными мембранами.
Содержимое внутри может быть выбрано по мере необходимости. Используя эти пептидные пузырьки, мы можем теперь смотреть вперед на более сложные реакции синтеза внутри них.
