Protokolümüzde, peptitlerden yapılmış reaksiyon bölmeleri oluşturmak için küçük cam boncuklardan film yeniden hidrasyon uyguluyoruz. Deneylerde, protokolün basitliğinden ve sağlamlığından faydalanıyoruz. Bu tekniğin en büyük avantajı, kullanılan ham hücre özü gibi hassas numuneleri bile dahil edebilme yeteneğidir.
Organik çözücülerle temas numuneyi önemli ölçüde etkileyecektir. Bu prosedüre başlamak için, ELP çözeltisini 1.1 milimolara yoğunlaştırmak için santrifüj vakum konsantratörü kullanın. Bu konsantre çözeltinin 200 mikrolitresini 2-1 kloroform ve metanol karışımının 1,250 mikrolitresini karıştırın.
Girdap çözeltisi iyice karıştırmak için. Sonra, on mililitrelik yuvarlak alt şişe ye 1,5 gram küresel cam boncuk ekleyin. Yuvarlak alt şişeye ELP ve kloroform metanol çözeltisi ekleyin ve yavaşça karıştırmak için sallayın.
Şişeyi döner buharlaştırıcıya bağlayın. Hızı 150 RPM'ye ayarlayın ve sıvı oda sıcaklığında buharlaşana kadar basıncı yaklaşık dört dakika boyunca 20.000 pascal'a ayarlayın. Olası kaynama geriliği nedeniyle döner evaporatör kullanırken dikkatli olmak önemlidir.
Bundan sonra, gevşek cam boncuk kaybını önlemek için yuvarlak alt şişe nin açılması etrafında alüminyum folyo sarın ve kalan kloroform ve metanol buharlaşır sağlamak için, en az bir saat boyunca bir kurutucu içine şişe yerleştirin. Tek bir deney için, 100 miligram peptid kaplı cam boncukları 60 mikrolitre şişme çözeltisi ile karıştırın. Bu numuneyi 25 derecede beş dakika kuluçkaya yatırın.
Örnekleri hızlı bir şekilde santrifüj ve cam boncuk tortu için bir masa üstü santrifüj kullanın. Sonra veziküller içeren supernatant, toplamak için bir pipet kullanın. İlk olarak, daha iyi faz ayrımı sağlamak için bir mikro santrifüj tüp içinde roti-Fenol, kloroform veya izoamyl alkol 100 mikrolitre ile önceden saflaştırılmış plazmid DNA 100 mikrolitre karıştırın.
Tüpü altı kez hafifçe ters çevirin ve 16,000 kez g ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca santrifüj edin. Daha sonra, üst faza 200 mikrolitre kloroform ekleyin ve tüpü altı kez ters çevirin. Numuneyi 16,000 kez g ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüj edin.
Bundan sonra, pipet ayrı bir tüp için supernatant ve etanol yağış için üç molar sodyum asetat 10 mikrolitre ekleyin. 80 santigrat derecede bir mililitre soğuk etanol ekleyin ve numuneyi 80 derecede bir saat saklayın. Sonra, 16, 000 kez g ve 15 dakika boyunca dört derece santigrat örnek santrifüj.
Supernatant decant ve 20 santigrat derece soğuk% 70 etanol bir mililitre ekleyin. Santrifüj 16, 000 kez g ve dört santigrat derece beş dakika. Daha sonra, DNA peletrahatsız değil dikkatli olmak, pipetleme ile sıvı çıkarın.
Kalan etanol buharlaştırmak için yaklaşık 15 dakika oda sıcaklığında örnek saklayın. Bundan sonra, numune konsantrasyonunu 260 nanometrede emilim le ölçülen yaklaşık 300 nanomolar'a ayarlamak için numuneye ultra saf su ekleyin. Transkripsiyon-çeviri reaksiyonu hazırlamak için, hazırlanan ham hücre ekstraksiyonu ve buz üzerindeki reaksiyon tamponu izleyin.
60 mikrolitrelik reaksiyon karışımı için plazma DNA'sını reaksiyon tamponunun 37,5 mikrolitresine ekleyin, 28,7 mikrolitre ham hücre ekstresi ekleyin ve ultra saf suyla 58,8 mikrolitrelik son hacmi doldurun. Reaksiyon başlamadan hemen önce, T7RNA polimeraz çözeltisinin 1,2 mikrolitresini ekleyin ve pipetleri yukarı ve aşağı karıştırın. Deney süresince numuneyi ve şişlik çözeltisini 29 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, bu da genellikle dört ila sekiz saattir.
Veziküllerin iletim elektron mikroskobu görüntüleri, TX/TL ve hatta sadece PBS gibi çeşitli şişme solüsyonlarının vezikül oluşturmak için kullanılabileceğini göstermektedir. Her iki çözüm için de boyut belirleme düz bir adımdır. Dinamik ışık saçılımı, cam boncuk yöntemi olmadan hazırlanan veziküllerin 134 nanometre çapında sonuç verdiğini, cam boncuklar kullanıldığında %25'lik bir polidağılım la sonuçverdiğini, çapın %21'lik bir polidispersite sahip iki floresan proteinin floresan şiddeti ile ELP vezikülleri içinde ölçüldüğünde floresan plaka okuyucu kullanılarak ölçülür.
Vezikül oluşumundan sonra veziküllerin içeriği ve dış solüsyonun aynı olduğunu, bu nedenle protein ekspresyonunu bastırmak için kanamisin antibiyotiğinin dış solüsyona eklenmediğini belirtmek önemlidir. Bir kontrol olarak, Kanamisin de şişme çözeltisi eklenir, bu durumda vezikül içinde protein ifadesi bastırılır. Bu Kanamisin membran yoluyla diffüz olmadığını gösterir, ve sürekli iç ekspresyon bastırır, her zaman.
FRET tnes sonra membran içine ELP dahil göstermek için yapılır. Membran ELP'lerinin ekspresyonu üzerine, ek peptidler membrana dahil edilmiştir, bu da FRET çiftleri arasındaki ortalama mesafeyi arttırır ve bu da donör sinyalinin artmasına neden olarak sonuçlanır. Sunulan teknik basit reaksiyon kapları üretmek veya peptid bazlı membranlar ile yapay hücreler oluşturmak için kullanılabilir.
İçerideki içerik gerektiği gibi seçilebilir. Bu peptit vezikülleri kullanarak, şimdi içlerinde daha karmaşık sentez reaksiyonları üzerinde ileriye bakabilirsiniz.
