En nuestro protocolo, utilizamos la rehidratación de película a partir de pequeñas cuentas de vidrio para formar compartimentos de reacción hechos de péptidos. En los experimentos, nos beneficiamos de la simplicidad y robustez del protocolo. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de incorporar incluso muestras sensibles, como el extracto de célula bruta utilizado.
El contacto con disolventes orgánicos afectará significativamente a la muestra. Para comenzar este procedimiento, utilice un concentrador de vacío centrífugo para concentrar la solución ELP a 1,1 mililitros. Mezclar 200 microlitros de esta solución concentrada con 1,250 microlitros de una mezcla de cloroformo y metanol de dos a uno.
Vortex la solución para mezclar a fondo. A continuación, agregue 1,5 gramos de cuentas de vidrio esférico a un matraz inferior redondo de diez mililitros. Agregue la solución elP y el metanol cloroformo al matraz inferior redondo, y agite suavemente para mezclar.
Conecte el matraz a un evaporador rotatorio. Ajuste la velocidad a 150 RPM y regule la presión a 20.000 pascales durante aproximadamente cuatro minutos, hasta que el líquido se evapore a temperatura ambiente. Es importante tener cuidado al usar el evaporador rotatorio debido a un posible retraso en ebullición.
Después de esto, envuelva libremente la lámina de aluminio alrededor de la abertura del matraz inferior redondo para evitar la pérdida de cuentas de vidrio y coloque el matraz en un desecador durante al menos una hora, para asegurarse de que el cloroformo restante y el metanol se evaporan. Para un solo experimento, mezcle 100 miligramos de las cuentas de vidrio cubiertas por péptidos con 60 microlitros de una solución de hinchazón. Incubar esta muestra a 25 grados centígrados durante cinco minutos.
Utilice una centrífuga de mesa para centrifugar las muestras rápidamente y sedimentar las cuentas de vidrio. A continuación, utilice una pipeta para recoger el sobrenadante, que contiene las vesículas. En primer lugar, mezclar 100 microlitros del ADN plásmido pre purificado con 100 microlitros de Roti-Phenol, cloroformo o alcohol isoamilo en un tubo de micro centrífuga para permitir una mejor separación de fase.
Invierta suavemente el tubo hasta seis veces y centrifugar a 16.000 veces g y temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, agregue 200 microlitros de cloroformo a la fase superior e invierta el tubo hasta seis veces. Centrifugar la muestra a 16.000 veces g y a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Después de esto, pipetear el sobrenadante a un tubo separado y añadir 10 microlitros de tres molares de acetato de sodio para la precipitación de etanol. Agregue un mililitro de etanol frío a 80 grados Centígrados y guárdelo a 80 grados Celsius durante una hora. A continuación, centrifugar la muestra a 16.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 15 minutos.
Decantar el sobrenadante y añadir un mililitro de frío 70%etanol a 20 grados Celsius. Centrifugar a 16.000 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Luego, retire el líquido pipeteando, teniendo cuidado de no molestar el pellet de ADN.
Conservar la muestra a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos para evaporar el etanol restante. Después de esto, añadir agua ultra pura a la muestra para ajustar la concentración de la muestra a aproximadamente 300 nanomolares, que se mide por absorción a 260 nanómetros. Para preparar la reacción de transcripción-traducción, siga la extracción de células brutas preparadas y el búfer de reacción en el hielo.
Para una mezcla de reacción de 60 microlitros, agregue el ADN plasmático a 37,5 microlitros del tampón de reacción, agregue 28,7 microlitros de extracto de células brutas y llene con agua ultra pura a un volumen final de 58,8 microlitros. Justo antes de que comience la reacción, agregue 1,2 microlitros de la solución de polimerasa T7RNA, y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Incubar la muestra y una solución de hinchazón a 29 grados centígrados durante la duración del experimento, que suele ser de cuatro a ocho horas.
Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de vesículas muestran que se pueden utilizar varias soluciones de hinchazón, como TX/TL o incluso sólo PBS para formar vesículas. Para ambas soluciones, la determinación del tamaño es un paso directo. La dispersión dinámica de la luz muestra que las vesículas preparadas sin el método de las perlas de vidrio dan como resultado un diámetro de 134 nanómetros, con una polidispersidad del 25% Cuando se utilizan cuentas de vidrio, el diámetro da como resultado 168 nanómetros, con una polidispersidad del 21%La intensidad de fluorescencia de dos proteínas fluorescentes, que se expresan dentro de las vesículas ELP, se miden entonces utilizando un lector de placas de fluorescencia.
Es importante tener en cuenta que después de la formación de vesículas, el contenido de las vesículas y la solución externa son los mismos, por lo tanto, el antibiótico Kanamicina se añade a la solución exterior para suprimir la expresión de proteínas. Como control, la kanamicina también se añade a la solución de hinchazón, en cuyo caso se suprime la expresión proteica dentro de la vesícula. Esto indica que la kanamicina no se difunde a través de la membrana, y suprime la expresión interna constantemente, todo el tiempo.
A continuación, se realiza el ensayo FRET para demostrar la incorporación de ELP en la membrana. Tras la expresión de los ELP de membrana, los péptidos adicionales se incorporan a la membrana, lo que aumenta la distancia media entre los pares fret, y que resulta en un aumento de la señal del donante. La técnica presentada se puede utilizar para producir recipientes de reacción simples o para crear células artificiales con membranas basadas en péptidos.
El contenido interior se puede elegir según sea necesario. Mediante el uso de estas vesículas péptidos, ahora podemos mirar hacia adelante en reacciones de síntesis más complejas dentro de ellos.
