Em nosso protocolo, usamos re-hidratação de filme de pequenas contas de vidro para formar compartimentos de reação feitos de peptídeos. Em experimentos, beneficiamos da simplicidade e robustez do protocolo. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de incorporar até mesmo amostras sensíveis, como o extrato de célula bruta usada.
O contato com solventes orgânicos afetará significativamente a amostra. Para iniciar este procedimento, use um concentrador de vácuo centrífugo para concentrar a solução ELP a 1,1 mililitro. Misture 200 microliters desta solução concentrada com 1.250 microliters de uma mistura de clorofórmio e metanol de dois a um.
Vórtice a solução para misturar completamente. Em seguida, adicione 1,5 gramas de contas de vidro esférica a um frasco fundo redondo de dez mililitros. Adicione a solução de metanol ELP e clorofórmio ao frasco fundo redondo e agite suavemente para misturar.
Conecte o frasco a um evaporador rotativo. Ajuste a velocidade para 150 RPM e regular a pressão para 20.000 pascals por aproximadamente quatro minutos, até que o líquido seja evaporado à temperatura ambiente. É importante ter cuidado ao usar o evaporador rotativo devido a um possível retardo de ebulição.
Depois disso, enrole vagamente a folha de alumínio em torno da abertura do frasco fundo redondo para evitar a perda de contas de vidro e coloque o frasco em um dessecador por pelo menos uma hora, para garantir que o clorofórmio restante e o metanol sejam evaporados. Para um único experimento, misture 100 miligramas das contas de vidro cobertas de peptídeos com 60 microliters de uma solução de inchaço. Incubar esta amostra a 25 graus Celsius por cinco minutos.
Use uma centrífuga de mesa para centrifugar as amostras rapidamente e sedimentar as contas de vidro. Em seguida, use uma pipeta para coletar o supernatante, que contém as vesículas. Primeiro, misture 100 microlitadores do DNA plasmídeo pré-purificado com 100 microlitres de roti-phenol, clorofórmio ou álcool isoamílico em um tubo de micro centrífugas para permitir uma melhor separação de fase.
Inverta suavemente o tubo até seis vezes e centrífuga a 16.000 vezes g e temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione 200 microliters de clorofórmio à fase superior, e inverta o tubo até seis vezes. Centrifugar a amostra a 16.000 vezes g e temperatura ambiente por cinco minutos.
Depois disso, pipete o supernascer a um tubo separado e adicione 10 microliters de três acetato de sódio molar para precipitação de etanol. Adicione um mililitro de etanol frio a 80 graus Celsius e armazene a amostra a 80 graus Celsius por uma hora. Em seguida, centrifugar a amostra a 16.000 vezes g e quatro graus Celsius por 15 minutos.
Decante o supernascido e adicione um mililitro de etanol frio de 70% a 20 graus Celsius. Centrifugar a 16.000 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, remova o líquido por pipetação, tomando cuidado para não perturbar a pelota de DNA.
Armazene a amostra à temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos para evaporar o etanol restante. Depois disso, adicione água ultra pura à amostra para ajustar a concentração amostral a aproximadamente 300 nanomolar, que é medida por absorção em 260 nanômetros. Para preparar a reação de transcrição-tradução, siga a extração celular bruta preparada e o tampão de reação no gelo.
Para uma mistura de reação de 60 microliteres, adicione o DNA de plasma a 37,5 microliters do buffer de reação, adicione 28,7 microliters de extrato celular bruto e preencha com água ultra pura a um volume final de 58,8 microliters. Logo antes da reação começar, adicione 1,2 microliters da solução de polimerase T7RNA e pipeta para cima e para baixo para misturar. Incubar a amostra e uma solução de inchaço a 29 graus Celsius durante a duração do experimento, que normalmente é de quatro a oito horas.
Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de vesículas mostram que várias soluções de inchaço, como TX/TL ou mesmo apenas PBS, podem ser usadas para formar vesículas. Para ambas as soluções, a determinação do tamanho é um passo direto. A dispersão dinâmica da luz mostra que as vesículas preparadas sem o método de contas de vidro resultam em um diâmetro de 134 nanômetros, com uma polidispersidade de 25% Quando as contas de vidro são usadas, o diâmetro resulta em 168 nanômetros, com uma polidispersidade de 21%A intensidade de fluorescência de duas proteínas fluorescentes, que são expressas dentro das vesículas ELP, são então medidas usando um leitor de placas de fluorescência.
É importante notar que após a formação da vesícula, o conteúdo das vesículas e da solução externa são os mesmos, assim, o antibiótico Kanamycin é adicionado à solução externa para suprimir a expressão proteica. Como controle, a kanamicina também é adicionada à solução de inchaço, nesse caso a expressão proteica dentro da vesícula é suprimida. Isso indica que a Kanamicina não se difunde através da membrana, e suprime a expressão interna constantemente, o tempo todo.
O ensaio FRET é então realizado para demonstrar a incorporação de ELP na membrana. Após a expressão dos ELPs de membrana, peptídeos adicionais se incorporam à membrana, o que aumenta a distância média entre os pares DE FRET, e o que resulta em um aumento do sinal de doador. A técnica apresentada pode ser usada para produzir recipientes de reação simples ou para criar células artificiais com membranas à base de peptídeos.
O conteúdo interno pode ser escolhido conforme necessário. Usando essas vesículas de peptídeos, agora podemos olhar para a frente em reações de síntese mais complexas dentro delas.
