In unserem Protokoll verwenden wir die Filmrehydratation aus kleinen Glasperlen, um Reaktionsfächer aus Peptiden zu bilden. In Experimenten profitieren wir von der Einfachheit und Robustheit des Protokolls. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, auch empfindliche Proben, wie den verwendeten Rohzellextrakt, zu integrieren.
Der Kontakt mit organischen Lösungsmitteln wird die Probe erheblich beeinflussen. Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie einen Zentrifugalvakuumkonzentrator, um die ELP-Lösung auf 1,1 Millimolar zu konzentrieren. Mischen Sie 200 Mikroliter dieser konzentrierten Lösung mit 1, 250 Mikrolitern eines Zwei-zu-Eins-Chlor-Und-Methanol-Gemischs.
Wirbel die Lösung gründlich zu mischen. Als nächstes fügen Sie 1,5 Gramm kugelförmige Glasperlen zu einem zehn Milliliter runden Bodenkolben hinzu. Fügen Sie die ELP- und Chloroform-Methanol-Lösung in den runden Bodenkolben und schütteln Sie sie vorsichtig.
Schließen Sie den Kolben an einen Rotationsverdampfer an. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf 150 Umdrehungen pro Minute ein und regulieren Sie den Druck für etwa vier Minuten auf 20.000 Pascal, bis die Flüssigkeit bei Raumtemperatur verdampft ist. Es ist wichtig, vorsichtig zu sein, wenn Sie den Rotationsverdampfer aufgrund einer möglichen Siedeverzögerung verwenden.
Danach die Aluminiumfolie locker um die Öffnung des runden Bodenkolbens wickeln, um den Verlust von Glasperlen zu verhindern und den Kolben mindestens eine Stunde lang in einen Trockenkörper zu legen, um sicherzustellen, dass die verbleibenden Chloroformen und Methanolverdampfen verdampfen. Für ein einzelnes Experiment 100 Milligramm der Peptid bedeckten Glasperlen mit 60 Mikroliter einer Schwellungslösung mischen. Inkubieren Sie diese Probe bei 25 Grad Celsius für fünf Minuten.
Verwenden Sie eine Tischzentrifuge, um die Proben schnell zu zentrifugieren und die Glasperlen zu sedimentieren. Verwenden Sie dann eine Pipette, um den Überstand zu sammeln, der die Vesikel enthält. Mischen Sie zunächst 100 Mikroliter der vorgereinigten Plasmid-DNA mit 100 Mikrolitern Roti-Phenol, Chloroform oder Isoamylalkohol in einem Mikrozentrifugenrohr, um eine bessere Phasentrennung zu ermöglichen.
Umdrehen Sie das Rohr bis zu sechs Mal und Zentrifugen bei 16.000 mal g und Raumtemperatur für fünf Minuten. Dann 200 Mikroliter Chloroform in die obere Phase geben und das Rohr bis zu sechsmal invertieren. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 mal g und Raumtemperatur für fünf Minuten.
Danach den Überstand in ein separates Rohr pipette und 10 Mikroliter drei Molnatriumacetat für die Ethanolfällung hinzufügen. Fügen Sie einen Milliliter kaltes Ethanol bei 80 Grad Celsius hinzu und lagern Sie die Probe bei 80 Grad Celsius für eine Stunde. Als nächstes zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 mal g und vier Grad Celsius für 15 Minuten.
Dekantieren Sie den Überstand und fügen Sie einen Milliliter kaltes 70%Ethanol bei 20 Grad Celsius hinzu. Zentrifuge bei 16.000 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie dann die Flüssigkeit durch Pipettieren, wobei Sie darauf achten, das DNA-Pellet nicht zu stören.
Die Probe bei Raumtemperatur ca. 15 Minuten aufbewahren, um das restliche Ethanol zu verdampfen. Fügen Sie anschließend ultrareines Wasser in die Probe ein, um die Probenkonzentration auf ca. 300 Nanomolar anzupassen, die durch Absorption bei 260 Nanometern gemessen wird. Um die Transkriptions-Translation-Reaktion vorzubereiten, folgen Sie der vorbereiteten Rohzellextraktion und dem Reaktionspuffer auf Eis.
Für einen 60-Mikroliter-Reaktionsmix die Plasma-DNA zu 37,5 Mikrolitern des Reaktionspuffers hinzufügen, 28,7 Mikroliter Rohzellextrakt hinzufügen und mit ultrareinem Wasser auf ein Endvolumen von 58,8 Mikroliter füllen. Unmittelbar bevor die Reaktion beginnt, 1,2 Mikroliter der T7RNA-Polymerase-Lösung und Pipette nach oben und unten geben, um sie zu mischen. Inkubieren Sie die Probe und eine Schwellungslösung bei 29 Grad Celsius für die Dauer des Experiments, die in der Regel vier bis acht Stunden beträgt.
Transmissionselektronenmikroskopiebilder von Vesikeln zeigen, dass verschiedene Quelllösungen, wie TX/TL oder auch nur PBS, zur Bildung von Vesikeln verwendet werden können. Für beide Lösungen ist die Größenbestimmung ein gerader Schritt. Dynamische Lichtstreuung zeigt, dass Vesikel, die ohne die Glasperlenmethode hergestellt werden, zu einem Durchmesser von 134 Nanometern führen, mit einer Polydispersität von 25%Wenn Glasperlen verwendet werden, ergibt sich der Durchmesser in 168 Nanometern, mit einer Polydispersität von 21%Die Fluoreszenzintensität von zwei fluoreszierenden Proteinen, die in den ELP-Vesikeln exprimiert werden, wird dann mit einem Fluoreszenzleser gemessen.
Es ist wichtig zu beachten, dass nach der Vesikelbildung der Inhalt der Vesikel und der äußeren Lösung gleich sind, so dass das Antibiotikum Kanamycin der äußeren Lösung zugesetzt wird, um die Proteinexpression zu unterdrücken. Als Kontrolle wird Kanamycin auch der Quelllösung zugesetzt, wodurch die Proteinexpression im Inneren des Vesikels unterdrückt wird. Dies deutet darauf hin, dass Kanamycin nicht durch die Membran diffundiert, und unterdrückt den inneren Ausdruck ständig, die ganze Zeit.
Der FRET-Assay wird dann durchgeführt, um die ELP-Inkorporation in die Membran nachzuweisen. Bei expression der Membran-ELPs werden zusätzliche Peptide in die Membran integriert, was den durchschnittlichen Abstand zwischen den FRET-Paaren erhöht und zu einer Erhöhung des Spendersignals führt. Die vorgestellte Technik kann verwendet werden, um einfache Reaktionsbehälter zu produzieren oder künstliche Zellen mit Peptid-basierten Membranen zu erstellen.
Der Inhalt im Inneren kann nach Bedarf ausgewählt werden. Durch die Verwendung dieser Peptidvesik, können wir jetzt auf komplexere Synthesereaktionen in ihnen freuen.
