Когда определенная белковая функция изменяется путем манипуляции с генами, координация раздражающих отказов и нарушения работы двигателя считается необходимым условием причинно-следственной связи между LTD и моторным обучением. Здесь мы демонстрируем использование нескольких протоколов для оценки LTD, которые могут быть индуцированы с помощью компенсационных механизмов в генно-манипулируемых животных. Перед сбором мозга, охладить и оксигенировать два 50 миллилитров стаканов ACSF на льду.
Когда температура раствора достигнет ниже четырех градусов по Цельсию, добавьте 50 микролитров одного миллимолярского тетродотоксина в один из ледяных стаканов. Для сбора урожая мозга, держать голову и использовать офтальмологические ножницы, чтобы сократить поверхностную кожу вдоль средней линии. Вручную втягивать кожу широко подвергать поверхности черепа и использовать ножницы, чтобы сократить вдоль черепа горизонтально от основных spinocerebellar отверстие чуть выше глаз и ушей, прежде чем резки черепа вдоль линии над обоими глазами.
Используйте скальпель, чтобы вырезать мозг в середине мозжечка и изолировать caudal часть мозга, в том числе мозжечка, от черепа. Погрузите образец в ледяной стакан ACSF и отрегулируйте пузырьковые трубки так, чтобы он не перемешивал мозговой блок в стакане. После по крайней мере семь минут, использовать шпатель, чтобы забрать блок мозга и использовать кусок фильтровальной бумаги, чтобы поглотить любой избыток ACSF.
Гора ткани брюшной стороне вниз на два на два сантиметра кусок агара с соответствующим медицинским клеем. Используйте лезвие, чтобы вырезать правое полушарие ткани мозга, как параллельно дендритической плоскости клеток Purkinje насколько это возможно. Вырезать и удалить другую сторону полушария и сократить мозг между начальником и нижней колликули.
Отрежьте спинной мозг и приклейте правую сторону подстриженного мозжечка агарным блоком на предварительно охлажденный лоток образца. Затем, наклоняя лоток образца, вылейте ACSF на образец, чтобы исправить ткани и смыть любой избыток клея. Чтобы нарезать образец мозга, сориентировать образец так, что спинная сторона мозжечка находится на фронте и залить достаточно ледяной резки ACSF дополнен тетродотоксин полностью погрузить мозжечок.
Поместите газовую трубку в режущие растворы и инициируем восходящее с кислородно-углеродной газовой смесью. Используя тонкие пинцеты и magnifiers, удалить арахноидальный матер и акциз мозжечковый педункул. После удаления ствола мозга и агар-блока поверните лоток на 180 градусов так, чтобы спинная поверхность мозжечка столкнулась с лезвием бритвы вибромы и отрегулируйте первое место резки.
Установите амплитуду вибромы до 5,5 и частоту до 85 Герц, скорость до трех-четырех, и толщина ломтика до 300 микрометров. По мере получения мозжечковых ломтиков используйте нейлоновую сетку для переноса секций в акриловый инкубатор в водяной бане по 26 градусов по Цельсию и полностью погружайте образцы в свежий оксигенированный ACSF в течение по крайней мере одного часа. Для всей отчетности патч клетки, растворить один микромолярный пикротоксин в ACSF путем ultasonication в течение трех минут, прежде чем perfusing 30 градусов по Цельсию записи камеры с раствором токсина на два миллилитров в минуту скорости потока.
Через несколько минут перенесите мозжечок в камеру записи и зафиксните ткань платиновым весом и нейлоновыми нитями. Затем заполните стимулирующий электрод свежим ACSF. Чтобы стимулировать параллельные волокна, поместите стимулирующий электрод на поверхность молекулярного слоя примерно в 50 микрометрах от слоя клеток Пуркинье.
Для стимуляции альпинистских волокон поместите стимулирующий электрод на дно клеточного слоя Пуркинье и используйте микрозагрузчик для заполнения записывающего электрода восемью микролитров 0,45 микрометра фильтрованного калия или внутреннего раствора на основе цезия. Нанесите слабое положительное давление на записывающий электрод перед погружением электрода в ACSF. Сопротивление электродов должно быть от двух до четырех мегаохм, а потенциал жидкого соединения должен быть исправлен.
Подойди к здоровому яркому клеточному телу клетки Пуркинье с помощью записывающего электрода и слегка нажмите поверхность клетки Пуркинье. Затем прекратите применять положительное давление и применять отрицательное давление до тех пор, пока не образуется уплотнение гигаома. Затем используйте отрицательное давление, чтобы установить конфигурацию всей клетки, поддерживая мембранный потенциал на уровне минус 70 милливольт и применяя минус два милливольта 100 миллисекундных импульсов на 0,1 герца, непрерывный мониторинг сопротивления входных данных, сопротивления серии и емкости ввода.
Для длительной индукции депрессии, стимулировать молекулярный слой с 0,1 миллисекундного импульса и применять двойной импульс стимул для выявления параллельного волокна возбуждающей пост-синаптических токов. Следует наблюдать парное упрощение импульса и постепенное увеличение амплитуды по отношению к увеличению интенсивности стимуляции. Чтобы записать тестовый ответ, применить один 0,1 герц импульса и настроить интенсивность стимула так, что вызвал амплитуду составляет около 200 пикоампер.
Стимулировать восхождение волокон в нижней части слоя клеток Purkinje и определить параллельное волокно возбуждающей пост-синаптических течений, вызвано восхождение активации волокна, применять двойной импульс стимул. Парная депрессия пульса должна наблюдаться в целом или нет образом в корреляции с увеличением интенсивности стимуляции. В этом репрезентативном эксперименте для подготовки ломтика использовалось соединение одной параллельной стимуляции волокна и одной стимуляции альпинистского волокна в нынешних условиях зажима.
Форма сложного шипа, вызываемого конъюнктурной стимуляцией, была похожа на форму, вызванную стимуляцией альпинистского волокна только с первым крутым шипом, за которым следовали два-три шипа. Аналогичным образом формы сложный всплеск наблюдался, когда одна параллельная стимуляция волокна последовало 50 миллисекунд позже конъюнктивной второй параллельной и альпинистской стимуляции волокна. В этом тесте в условиях зажима напряжения с использованием внутреннего раствора на основе цезия параллельной стимуляции волокна последовало 50 миллисекунд позже сопутствуя применению второй параллельной стимуляции волокна и соматической деполяризации.
Внутреннее течение было вызвано соматической деполяризацией от минус 70 до нуля милливольт, и хвостовой ток также был вызван после реполяризации. Наконец, пять параллельных стимулов волокна на 100 герц были даны одновременно с соматической деполяризации в условиях зажима напряжения. Опять же, во время деполяризации было получено повторяющееся поколение внутренних течений, и хвостовой ток был вызван после реполяризации.
Для оценки взаимосвязи между мозжечковой LTD и двигательного обучения в генных манипулировать животных, несколько протоколов должны быть использованы для индуцирования LTD в уютных физиологических условиях. Если мозжечок LTD визуализируется у генно-манипулируемых животных после моторного обучения, причинно-следственная связь между ними может быть более непосредственно изучены.
