Органотипическая культура ломтика является мощным инструментом для изучения нейроразвития и дегенеративных или регенеративных процессов. Этот метод может быть использован для быстрого экрана молекул кандидата для их нейропротекторного потенциала. Этот метод тесно имитирует условия in vivo, по сравнению с диссоциированными культурами первичных клеток, так как архитектура тканей и родных клеточных соединений сохраняются в плоскостях секций.
Здесь мы демонстрируем изучение смерти клеток Пуркинье в развивающемся мозжечках. Но органотипическая культура ломтика одинаково подходит для моделирования нейродегенеративных заболеваний почти в каждом регионе центральной нервной системы. Демонстрацией процедуры с Дженнифер Ракотомамонджи будет Шон МакДермотт, техник из моей лаборатории.
Перед сбором мозжечковых ломтиков, в стерилизованный шкаф биобезопасности, заполнить каждый колодец из шести скважин культуры пластины с одним миллилитр вакуумной фильтрованной среды культуры, и добавить фармакологический агент интерес для обработки скважин, и равный объем транспортного средства для управления скважин. Используя стерильные тибры, поместите один 0,4-микрометровый поры размером PTFE мембранный фильтр вставить в каждую колодец, заботясь, чтобы избежать пузырьков на стыке каждой мембраны и среды, и уравночные среды в 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа инкубатор в течение двух часов. Чтобы собрать мозжечок, используйте прямые миппы для вязки, чтобы схватить щенка за нос, и использовать ножницы для прямых глаз, чтобы разрезать кожу головы от заднего конца боковой до средней линии.
Разрежьте череп таким же образом, указывая ножницами советы наружу, чтобы избежать повреждения мозжечка, и использовать шпатель для передачи мозга на 60-миллиметровое блюдо, содержащее холодный HBSS и пять миллиграммов на миллилитр глюкозы. Используйте прямые вязки соусом, чтобы тщательно вскрыть мозжечок, и использовать стерильные изогнутые тонкие миппы, чтобы поместить ткань на пластиковый диск на режущей таблице измельчителя ткани. Поверните режущие таблицы, чтобы сориентировать ткань, чтобы приобретение паразагиттальных секций, и потяните ручку выпуска стола вправо, чтобы переместить режущей стол, пока лезвие не будет расположено на краю ткани.
Затем отрегулируйте толщину ломтика до 350 микрометров, а скорость лезвия до средней, и запустите вертолет. Когда весь мозжечок будет разрезан, выключите вертолет. Используя стерильные типсы, держите диск над новым 60-миллиметровым блюдом.
Используйте передачу пипетки, чтобы промыть HBSS плюс глюкозу над диском, так что ломтики попадают в блюдо. Затем, касаясь образцов как можно меньше, используйте микропроб, чтобы отделить ломтики. Используйте передачу пипетки, чтобы выбрать разделы мозжечка близко к верме на отдельные вставки культуры клеток в шесть хорошо пластины, и использовать микропроб для позиционирования ломтиков в центре каждой вставки.
Когда все ломтики были помещены, тщательно аспирировать любые излишки HBSS плюс глюкоза, и вернуть пластину в инкубатор культуры клеток. Для окрашивания иммунофторесценции, удалить супернатант из каждого хорошо, и мыть вставки с PBS. Зафиксировать ломтики с одним миллилитров холодного 4%paraformaldehyde в хорошо каждой вставки, и 500 микролитров на верхней части каждой вставки в течение одного часа.
В конце фиксации, мыть вставки четыре раза в течение 10 минут с одним миллилитров свежего PBS под каждой вставкой и 500 микролитров свежего PBS поверх каждой вставки на стирку на орбитальном шейкере. Предварительно заполните каждый колодец 24-хорошо пластины с 500 микролитров PBS-TB, и использовать кисть для передачи мозжечковых ломтиков из каждой клеточной культуры вставить в отдельные колодцы 24-хорошо пластины. Permeabilize и блокировать ломтики при комнатной температуре в течение одного часа.
В конце инкубации, этикетка клеток с 200 микролитров первичного антитела интерес разбавленной в PBS-TB на ночь при четырех градусах по Цельсию на орбитальном шейкере. На следующее утро, мыть ломтики четыре раза в течение 10 минут и 500 микролитров свежего PBS на стирку на шейкере, прежде чем маркировать образцы с соответствующими фторфор-конъюгированных вторичных антител в течение двух часов при комнатной температуре на шейкере, защищенный от света. В конце инкубации счетчики с 500 микролитров соответствующего ядерного пятна на колодец в течение 10 минут при комнатной температуре, защищенные от света.
И использовать передачу пипетки для установки ломтиков на стеклянные горки. Затем дайте секциям полностью высохнуть перед регидратанием с помощью PBS и монтажом тканей с крышками, покрытыми примерно 80 микролитров монтажной среды. После того, как монтажная среда вылечилась, мозжечковые секции готовы к изображению.
На послеродовой шестой день выживаемость клеток Пуркинье низка в контрольных образцах, что соответствует их известному окну уязвимости. Выживаемость увеличивается по мере того, как животное-донор стареет и выходит из этого критического периода. Лечение мозжечковых ломтиков с высокой концентрацией хлорида калия приводит к успешной индукции их деполяризации и выживания.
Для получения последовательных и воспроизводимых результатов крайне важно выбрать здоровые мозжечковые секции и как можно более эффективно выполнять настройку культуры. Пост-культурные приложения выходят за рамки иммунофлуоресценции. Как органотипические ломтики могут быть использованы для исследования экспрессии белка генома, а также для мониторинга активности нейрональной цепи с использованием электрофизиологии и живой визуализации кальция.
