Мы изучали наличие растворимости микрометаллов, таких как цинковый селен, с различными химическими формами или источниками, как мы его называем, в контексте изменения состава корма. В радионуклидном наборе взвесьте приблизительно 0,2 грамма образцов корма для молотого атлантического лосося и смешайте его с радиоиндикатором цинка известной специфической активности в пробоотборной трубке объемом в пять миллилитров. Подготовьте шесть других аликвот буфера и добавьте одну из аминокислот, показанных здесь, к каждой, чтобы достичь конечной молярной концентрации в пять миллимоляров.
Добавьте пресноводный кишечный просветный буфер для подачи образца. Затем добавьте пресноводный кишечный просветный буфер к буферным аликвоткам, содержащим аминокислоты. Закройте трубки и вращайте их на ротационном спиннере со скоростью 25 оборотов в минуту в течение 30 минут.
Затем центрифугируют по 1, 157 х г в течение 10 минут, чтобы отделить растворимые и нерастворимые фракции. Используйте гамма-кассиру для измерения количества в минуту радиоиндикатора цинка в растворимых и нерастворимых фракциях. Дважды промыть клеточную линию кишечника радужной форели одним миллилитром раствора ЭДТА и выкачивать раствор после каждой промывки пипеткой.
Обработать промытые клетки 0,25% раствором трипсина. Осторожно поверните колбу под острыми углами в течение двух минут. Затем добавляют 10 миллилитров среды L-15, содержащей 5% FBS, чтобы нейтрализовать трипсин.
Используя стерильную пипетку, декантировать полученную суспензию ячейки в коническую нижнюю центрифужную трубку. Центрифуга при 130 x G в течение трех минут. Затем с помощью гемоцитометра определяют плотность собранных клеток методом ручного подсчета.
Посейте клетки на 24 пластины лунки при плотности клеток 50 000 клеток на миллилитр на лунку и инкубируйте пластины при 19 градусах Цельсия в нормальной атмосфере в течение 48 часов до экспериментов. После кормления рыб в течение 11 дней и усыпления их, соберите объединенный образец фекалий рыбы, сняв с вентрального плавника до ануса и поместите его на тарелку. Используйте шпатель для переноса кала с пластины в коническую трубку размером 50 миллилитров.
Немедленно храните образцы при 20 градусах Цельсия. В этом исследовании минеральная доступность кормов для рыб оценивается с использованием ряда дополнительных методов. Репрезентативный анализ кормов атлантического лосося с помощью метода масс-спектрометрии плазменной масс-спектрометрии с исключением размеров индуктивно-связанной плазмы дает данные о химических видах цинка, обнаруженных в растворимой фракции.
В этой фракции можно увидеть пять пиков, содержащих цинк, каждый с различной молекулярной массой. Химические вещества цинка, обнаруженные в растворимой фракции, могут иметь различные источники, потому что используемый корм содержит как морские, так и растительные ингредиенты и дополняется. Диапазон молекулярной массы этих видов предполагает, что эти соединения могут быть металлопротеинами.
В то время как растворимость дополненного цинка 65 увеличивает присутствие всех протестированных аминокислот, более высокая растворимость обнаруживается с гистидином и лизином. На поглощение апикального цинка в клетках Arteca GC значительно влияет присутствие L-Met или DL-Met в двух миллимолярных концентрациях. Кроме того, на влияние метионина на поглощение цинка отрицательно влияет присутствие МГБ.
Основным преимуществом этого протокола является то, что мы попытались объединить различные подходы в визуальных, аналитических и инвиво-исследованиях, сравнить и дополнить друг друга, когда дело доходит до изучения минеральной доступности.
