Рыбки данио являются привлекательной моделью, но ученые не знают, насколько организм поднимается с помощью дозирования, передаваемого через воду. Мы разработали методику переваривания тканей после воздействия и количественной оценки металлов с помощью ICPMS. Этот метод позволяет нам точно количественно оценить и проверить реакцию дозы с помощью ICPMS.
Этот метод имеет большой потенциал. Фармакологическое или экологическое воздействие металлов может быть применено от клеточного уровня до целых систем органов на животных моделях. Добавьте приблизительно 0,25 миллилитра азотной кислоты высокой чистоты в 15-миллилитровые полипропиленовые центрифужные трубки для 10 личинок.
Ультразвуком в течение одного часа для предварительного переваривания образцов. Для ультразвуковой обработки выполняйте короткие циклы переваривания тканей с пятиминутными интервалами в кислотно-безопасном микроволновом реакторе до тех пор, пока вся ткань не будет заметно окислена, получая однородный, прозрачный желтый раствор. Тщательно контролируйте целостность труб, чтобы избежать разрыва и проводить короткие вращения в центрифуге между циклами.
Как только ткань будет заметно окислена, разбавьте образцы в вытяжке до 3,5% азотной кислоты, используя 6,75 миллилитра воды высокой чистоты и вихря для тщательного смешивания. Затем провести 7-точечную калибровочную кривую с матрицей для учета любых потенциальных изобарических помех. Используя запасную концентрацию водного сертифицированного элементарного стандарта, возьмите 0,1 миллилитра аликвот и путем пипетки в новую 15-миллилитровую центрифужную трубку.
Разбавляют 3,5% азотной кислотой до конечного объема 10 миллилитров для получения 10 частей на миллиард стандартных растворов. Используя 10 частей на миллиард запасов, делайте серийные разбавления 0,1, 1,0 и 5,0 частей на миллиард стандартных растворов в 3,5% азотной кислоты. Используя запас 0,1, производят серийные разведения 0,001, 0,005 и 0,01 частей на миллиард стандартных растворов в 3,5% азотной кислоте.
Затем, прежде чем подготовить прибор ICPMS для анализа проб, убедитесь, что клапан аргонового газа открыт, вся трубка надежно подключена и очищена, 5% азотной кислоты открыто для промывки трубок и стеклянной посуды между анализами образцов. Проверьте состояние горелки и конусов и убедитесь, что коробка горелки надежно закреплена. А дренажная трубка распылительной камеры правильно подключена к перипумпу.
Откройте программное обеспечение, проверьте показания вакуума и убедитесь, что все турбонасосы работают на 100%, нажмите кнопку START в окне состояния системы Plasma Control, чтобы инициировать последовательность запуска. Включите плазменный насос и плазменный чиллер, установите небулайзер и зажгите плазму. Подождите, пока плазма загорится и стабилизируется, когда в окне Status появится сообщение о завершении последовательности запуска.
На этом этапе обратите внимание на зеленые точки в окне состояния системы, которые указывают на то, что все блоки питания включены. В строке меню нажмите Control, Autosampler в выпадающем меню. Войдите в положение стойки автопробоотборника для трубки, содержащей 5% азотной кислоты, позвольте кислоте попасть в плазму.
В строке меню нажмите На Сканы, Магнит в выпадающем меню. В окне MagnetScan введите 115 в поле Положение массы маркера и нажмите кнопку ВВОД. Позвольте магниту сканировать в диапазоне масс в течение 30 минут, пока инструмент нагревается.
Через 30 минут используйте элемент управления автоподборщиком, чтобы перейти в положение одной детали на миллиард многоэлементных настроек. Аспирируйте решение настройки и настройте прибор для оптимизации считывания сигнала. Отрегулируйте положение горелки для координат X, Y, Z таким образом, чтобы горелка выровнялась с центром конусов и скоростью потока небулайзера в окне «Контроль плазмы».
Внесите необходимые изменения в окне Настройка ионной оптики для источника, детектора и анализатора. После оптимизации считывания сигнала нажмите «Стоп» в окне «Сканирование магнитов», нажмите «Откалибровать магнит» и выберите «Низкое разрешение» во всплывающем окне. Нажмите кнопку ОК и откройте файл SMC калибровки массы, чтобы откалибровать магнит.
Нажмите кнопку Сохранить, Использовать, чтобы применить калибровку текущего магнита к анализу. При измерении неизвестных образцов с огромным диапазоном концентраций выполните калибровку детектора для сравнения сигналов подсчета ионных импульсов при низких концентрациях с ослабленными ионными сигналами, полученными при более высоких концентрациях. Начните анализ образца, щелкнув Сбор данных, затем выберите Настройка метода в раскрывающемся меню.
Используйте существующий метод, предоставленный производителем, или создайте метод на основе интересующих элементов. При необходимости отрегулируйте режим анализа, время ожидания, задержку переключения, количество разверток и циклов, разрешение, режим обнаружения и массу парковки для настроек дефлектора. Нажмите кнопку Сохранить, чтобы записать параметры метода.
Оптимизируйте параметры для каждого металла и изотипа. В строке меню выберите Сбор данных. Нажмите на Пакетный запуск в раскрывающемся меню.
Кроме того, можно щелкнуть значок BATCH под строкой меню, импортировать параметры пакета из электронной таблицы или создать последовательность в окне Batch Run. Введите тип образца, положение стойки автоподборщика, время передачи, время стирки, реплики, идентификатор образца и файл метода. Организуйте серийный пробег для стандартных решений для калибровочной кривой, а затем стандарт контроля качества, а затем неизвестные образцы.
Контролируйте дрейф прибора и воспроизводимость образцов, включая стандарт контроля качества 0,5 частей на миллиард каждые 5-10 образцов. Исследования поглощения тканей проводились с воздействием цисплатина на водной основе и нового противоракового соединения PMC79 на основе рутения. Летальность и задержка вылупления оценивались для номинальных концентраций цисплатина.
0, 3,75, 7,5 15, 30 и 60 миллиграмм на литр цисплатина. Накопление платины в тканях организма было определено анализом ICPMS, и ткань организма содержала соответствующие дозы 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 и 461,9 нанограмма на организм. Задержка вылупления наблюдалась при всех концентрациях цисплатина.
После дехорионации хорионы были собраны и проанализированы на платину отдельно. Нелетальные дозы цисплатина, используемые для исследований дехорионации, определили, что от 93 до 96% от общей дозы цисплатина накопилось в хорионе, а оставшаяся доза находится в ткани личинки. Личинки рыбок данио подвергались воздействию 0, 3,1, 6,2, 9,2 и 12,4 миллиграммов на литр PMC79.
Эти концентрации были аналитически определены как содержащие 0, 0,17, 0,44, 0,66 и 0,76 миллиграмма на литр рутения. В отличие от этого цисплатина, задержка вылупления не наблюдалась у личинок PMC79. Хорионы не были включены в анализ рутения, поскольку они естественным образом деградировали до сбора личинок.
Массивный металл в личиночных тканях, проанализированных в каждой концентрации, составлял 0,19, 0,41 и 0,68 нанограмма рутения на личинку. Любой из реагентов, добавленных в протокол воздействия, дает возможность для изобарических помех. Когда это возможно, рассмотрите альтернативы, такие как быстрое охлаждение по сравнению с трикаином.
Этот метод позволяет сравнивать дозу металла для токсичности, эффективности, экспериментов с более высокими позвоночными. Мы были особенно взволнованы тем, что наша пороговая доза была в пределах порядка величины, данной пациентам.
