Создание первичных клеточных моделей или органоидоподобных структур является ключом к ответу на многие современные вопросы в биологии. Например, мы были заинтересованы в течение довольно продолжительного времени в механизмах, используемых вирусами человека для облегчения репликации в слюнной железе, как это важное место для горизонтальной передачи. Развитие системы, основанной на салисфере, описанной в этом протоколе, является важнейшим достижением в нашем стремлении ответить на подобные вопросы.
Этот метод позволяет нам генерировать первичные клетки из различных образцов пациентов. Сотовые модели больше напоминают ситуацию типа in vivo, так как клетки не моделируются и не трансформируются, как многие типы клеток, обычно используемые для экспериментов в пробирке. Мы использовали этот протокол для генерации аналогичных клеток из мыши первичной подмандибулярной железы и протокол, вероятно, будет полезен для других органов с аналогичными клеточными структурами.
В течение двух-четырех часов после удаления у пациента, на культурной тарелке, используйте автоматически стерилизованные вскрытые ножницы и хирургические типсы, чтобы измельчить ткани слюнной железы на мелкие кусочки размером от одного до двух миллиметров. Добавьте шесть миллилитров раствора Dispase/Collagenase в фарш. Затем инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение примерно 30 минут до одного часа.
Нарушить ткани путем трубопроводов с пяти миллилитров серологического пипетки от 15 до 20 раз. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение еще 30 минут до одного часа. Повторите пипетки и инкубации шаг еще два-три раза или до тех пор, пока ткань напоминает суспензию и может легко пройти через пипетку открытия.
Чтобы покрыть скважины СММ, медленно пипетки 500 микролитров ночь размороженной BMM в каждый колодец из шести пластины хорошо. Медленно закружить пластину равномерно распределить BMM по скважинам. Затем инкубировать покрытием пластин при 37 градусах по Цельсию, по крайней мере за 15 минут до использования, чтобы BMM затвердеть.
Во-первых, перенесите раствор Dispase/Collagenase, содержащий гомогенизированную ткань, в 15 миллилитровую коническую трубку. Вымойте стенку пластины один раз с шестью миллилитров DPBS для передачи оставшихся клеток в коническую трубку. Затем через 70-метровый нейлоновый сетчатый клеточный ситечко фильтруем гомогенат в новую 50-миллилитровую коническую трубку для удаления непереваренной ткани.
Центрифуга напрягает клетки в течение пяти минут при 500 раз г. Аспирировать супернатанта. Затем повторно посовещение клеточной гранулы в 10 миллилитров буфера лиза 1X RBC.
Инкубировать в течение пяти минут при 37 градусах по Цельсию. Затем добавьте от 20 до 25 миллилитров DPBS, чтобы нейтрализовать буфер лиза РБК и свести к минимуму лиз слюнных клеток. Центрифуга в течение пяти минут при 500 раз г.
Белые клеточные гранулы указывают на полныйлиз всего РБК. Если гранулы красного цвета, повторите обработку буфером РБК лиза. Аспирировать супернатант и повторно использовать гранулы в один-два миллилитров BEGM, а затем передать перерасход клеток на BMM покрытием скважин.
Инкубация при 37 градусах по Цельсию. После того, как покрытие на BMM, клетки будут образовываться в сферические структуры или salispheres в течение двух-трех дней. Клетки могут поддерживаться в качестве salispheres в течение примерно пяти-семи дней, прежде чем BMM начинает деградировать позволяет клеткам получить доступ и придерживаться пластика и расти как монослой.
Во-первых, аспирировать средства массовой информации из скважин и добавить один миллилитр раствора Dispase/Collagenase к каждой скважине. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение примерно 15 минут или до тех пор, пока BMM в основном не растворился. Затем перенесите клетки в 15 миллилитровую коническую трубку и вымойте колодцы один раз с помощью одного-трех миллилитров DPBS, чтобы получить оставшиеся клетки.
Центрифуга в течение пяти минут при 500 раз г. Аспирировать супернатант и повторно помыть гранулы в двух миллилитров трипсина. Инкубировать снова при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут.
Затем добавьте в трубку любые полные средства массовой информации, содержащие 10%сыворотки, чтобы нейтрализовать трипсин. Центрифуга в течение пяти минут при 500 раз г. Аспирировать супернатант для удаления остаточного мультимедиа, трипсина и сыворотки, а затем повторно использовать клетки в DPBS.
Центрифуга в течение пяти минут при 500 раз г. Аспирировать супернатант и повторно помыть гранулы в BEGM. Для поддержания гранулы в качестве сфер, пластины повторного перерасхода клеток на затверденные BMM покрытием культуры блюд.
Культура всех клеток во влажном инкубаторе поддерживается на 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа в течение пяти-семи дней до подкаской. Кормите свежим BEGM каждые два-три дня. Для распространения клеток в качестве монослоя на пластиковые блюда культуры, аспирировать BEGM средств массовой информации из блюда и мыть один раз с DBPS для удаления остаточного средства массовой информации.
Добавьте два миллилитров трипсина и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут или до тех пор, пока клетки полностью отсоединились. Нейтрализовать трипсин с помощью четырех миллилитров любых полных средств массовой информации, содержащих 10%сыворотки. Затем аккуратно наклоните блюдо и перенесите клетки в 15 миллилитровую коническую трубку.
Вымойте пластину один раз с примерно пятью миллилитров DPBS для сбора оставшихся клеток. Центрифуга в течение пяти минут при 500 раз г. Аспирировать супернатанта.
Чтобы удалить остаточные средства массовой информации, повторно посовещенные ячейки в 6-10 миллилитров DPBS. Центрифуга в течение пяти минут при 500 раз г. Аспирировать супернатант и resuspend в BEGM.
Затем пластины клеток на обработанные пластиковые ткани культуры блюд. Культура клетки во влажном инкубаторе поддерживается на 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа в течение пяти-семи дней до субкульирования. Кормите свежим BEGM каждые два-три дня.
В этом протоколе, после покрытия клеток из переваренной ткани на BMM в течение двух-трех дней, клетки легко образуют небольшие кластеры, которые продолжали расширяться в размерах до 15 до 20 клеток на кластер. Салисферные клетки были потрощены на клетки культурных лечение пластика и выращивается как монослой, где они проявляют морфологии в соответствии с клетками эпителиального происхождения. Правильная асептическая техника и уход необходимы, чтобы избежать бактериального или грибкового загрязнения.
Никакое количество антибиотиков или антимикотики не спасет культуру, кишащих микробами. Мы отвечаем на вопросы о вирусном патогенеза и передачи инфекции. Но для других, это обеспечивает способ изучения человеческих слюнных клеток для любого количества приложений, таких как регенерация тканей терапии.
Для нас, кто изучает цитомегаловирус человека, этот метод позволил нам начать изучение молекулярных механизмов, которые вирус использует для заражения и в конечном итоге передать новым хозяевам. Ничто, используемое в этом протоколе, по своей сути опасно, но при обращении с человеческими тканями и любыми химическими реагентами всегда следует проявлять осторожность.
