Этот протокол позволяет оценки взаимодействия клеток с клетками между различными типами клеток в ткани, и ex vivo молекулярных и фармакологических манипуляций, которые были бы менее осуществимы in vivo. Основным преимуществом этого метода является длительный период времени эти секции тканей могут быть сохранены в культуре позволяет их оценки в более поздние моменты времени. Этот метод позволит более быстрый скрининг терапевтических соединений для коррекции повреждения слюнных желез и, скорее всего, уменьшить количество мышей, используемых для этих исследований.
Мы планируем использовать этот метод, чтобы понять реакцию слюнных желез на лучевую терапию в промежуточных точках времени и включить и выключить гены через определенные промежутки времени. Наиболее сложным аспектом этой процедуры является раздел тканей и предотвращение потери секций тканей во время культуры и окрашивания шагов. Перед началом процедуры дезинфицируют съемные вибромные компоненты 70%этанолом, за которыми следует УФ-стерилизация не менее 30 минут.
Закрените дополнительный лист лабораторной пленки над буферным лоток, чтобы предотвратить падение льда, и заполнить ледяную камеру дробленым льдом. Удалите лабораторную пленку из буферного лотка и заполните буферный лоток 100 миллилитров ледяного PBS, дополненного 1%пенициллин стрептомицин ампициллин, или PSA. Затем поместите лезвие бритвы из нержавеющей стали в держатель лезвия и используйте отвертку, чтобы облегчить регулировку угла лезвия.
После изоляции слюнных желез поместите собранную ткань в стерильное 30-миллиметровое культурное блюдо, содержащее два миллилитров ледяного PBS, дополненного 1%PSA. Используя автоматические типсы, перенесите железы на дно встраивающейся формы и накройте ткань жидкостью 3%low плавильной точки агарозы. Используя типсы, отрегулируйте ткань к середине блока в соответствующей плоскости, и поместите блок агарозы на лед в течение 10 минут.
Когда агароза затвердела, осторожно запустите лезвие бритвы вокруг внешнего края формы и пусть блок выскользнуть на УФ-стерилизованной лабораторной пленки. Используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать агарозную коробку, содержащую слюнную железу, заботясь о том, чтобы плоскость секции была прямой и параллельной противоположной стороне блока. Используйте суперклей, чтобы прикрепить блок к поверхности резки и получить 50 или 90 микрометров толщиной разделов на виброме на 0,075 миллиметра в секунду скоростью 100 герц частоты.
Затем используйте автоклавированную натуральную расческу для волос, чтобы перенести секции в отдельные колодцы 24 хорошо ткани культуры блюдо, содержащее один миллилитр ледяной PBS за а также они получены. Когда все разделы были приобретены, использовать и autoclaved микро шпатель для передачи разделов в отдельных 0,4 микрометра залить размер мембраны вставки в каждом хорошо из 24 хорошо ткани культуры пластины, содержащей 300 микролитров виброма культуры среды на колодец. Затем поместите пластину в 37 градусов по Цельсию и 5%углекислый газ инкубатор с влажностью, освежает среду в нижней части каждой хорошо, и добавить 40 микролитров среднего мембраны вставляет через день по мере необходимости на срок до 30 дней.
Чтобы облучить ткани, перенесите секции на облучатель в крытый контейнер из пенополистирола, чтобы избежать колебаний температуры и обработать секции одной пятиклассной дозой радиации. Затем верните культуры в инкубатор культуры радиационной безопасной ткани. Для антитела окрашивания тканей разделов, мыть образцы, по крайней мере две пять минут моет в стерильных PBS и исправить разделы в 4%paraformaldehyde при четырех градусах по Цельсию в одночасье.
На следующее утро мыть разделы три раза с PBS дополняется 1%бычьей сыворотки альбумин и 0,1%Triton X-100, или PBT, прежде чем пронизыть ткани с 0,3%Triton X-100 в PBS в течение 30 минут. Вымойте секции три раза в PBT, как попродемонстрировано, прежде чем блокировать любые неспецифические связывания с блокирующим агентом дополнен 1%нормальной сыворотки козы в течение одного часа. Затем инкубировать разделы на ночь в соответствующих первичных антител интересов.
Яркие изображения полевого микроскопа первичных культур секции слюнных желез 2D показывают наличие жизнеспособных тканей на срок до 30 дней культуры при всех концентрациях проверенных добавок сыворотки. Пролиферативная способность этих репрезентативных культурных ломтиков была оценена иммуностимулятором Ки-67, и этот маркер наблюдался во все моменты оценки. Низкий уровень клеток Cleaved Caspase-3 также наблюдался во все моменты времени с небольшим увеличением, обнаруженным в день 30.
E-кадерин окрашивание наблюдалось как в подумандибулярных и околоушных ломтиков железы в течение 30-дневного периода культуры. Гладкие мышцы актин-позитивных клеток и цитоскелет организации были обнаружены на аналогичных уровнях на протяжении всего периода культуры. Аналогичным образом, функциональные белки, такие как амилаза и аквапорин-5 были также обнаружены, хотя в день 14 окрашивание оказалось более гранулированным.
В отличие от этого, CD31 и TUBB3 не были последовательно выражены на протяжении всего периода культуры в обеих железах, что свидетельствует о том, что существует разнообразие компонентов тканей поддерживается в течение различных периодов времени в течение 30-дневного периода культуры. Облученые ломтики в обеих железах имитировали аналогичные пролиферативные апоптотические и цитоскелетные изменения, наблюдаемые in vivo. Будьте осторожны при перемещении секций из ванны PBS в виброме на культурную тарелку и во время процедур окрашивания, так как секции маленькие и деликатные.
Культуры раздела можно обработать с большинств методами культуры линии клетки с добавленной пользой быть под условиями которые близко связаны к in vivo. Мы ожидаем, что это будет мощный метод для других исследователей, чтобы включить в свои эксперименты. Лезвие на виброме является острым и может быть трудно вставить так устал при обработке.
Кроме того, trypan синий краситель является токсичным и канцерогенным, так что следуйте всем руководящим принципам PP.
