Полное понимание роли M-клеток в кишечном гомеостазе и иммунной защите отсутствует из-за редкости клеток М в кишечнике. Индуцированная дифференциация клеток M в человеческих кишечных стволовых клетках, полученных культур позволит для изучения развития M клеток и функций. Чтобы покрыть мембраны Transwell, поместите нужное количество Трансвеллс в пластину 24 хорошо, создавая двухкамерную систему.
Разбавить внеклеточной матрицы, или ECM, 25 раз в холодной стерильной фосфат буферной солевой раствор. Затем добавьте 100 микролитров холодного разбавленного раствора в каждую верхнюю камеру на мембрану. Обложка 24 хорошо пластины с крышкой, и поместите пластину в инкубатор культуры тканей при 37 градусов по Цельсию в течение двух часов, чтобы ECM затвердевание на мембране.
Через два часа снимите пластину с инкубатора и поместите в ткань культуры капюшона. Используя стерильные пинцеты, инвертировать каждый Transwell, чтобы аккуратно удалить оставшийся раствор. Позвольте мембранам высохнуть в капюшоне с открытой крышкой во время сбора клеток.
Удалите пластину иловые энтероиды из инкубатора, и осторожно удалить культуру средств массовой информации из каждого хорошо вакуумной аспирации или с пипеткой. Чтобы разбить ECM, добавьте 500 микролитров ледяной 0,5 миллимолярной ЭДТА к каждой хорошо содержащей илоидные энтероиды, приостановленные в ECM. Pipette вверх и вниз энергично с P1000 pipetter установлен на 500 микролитров, чтобы разбить ECM, тем самым выпустив ил enteroids в раствор.
Соберите раствор из каждой хорошо в 15 миллилитров конических труб. Пеллет клетки в центрифуге при 140G и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Пеллеты должны быть видны, но могут быть легко выбиты, так что медленно удалить supernatant вакуумной аспирации или с пипеткой.
Чтобы переварить тесные связи соединения и разбить иловых энтероидов на одиночные клетки, повторно гранулы в 500 микролитров трипсина комнатной температуры на каждые пять собранных скважин. Используя P1000 pipetter, пипетка вверх и вниз, чтобы дезагрегить сгустки. Инкубировать трубки в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение пяти минут или меньше.
Добавьте один миллилитр передового DMEM F-12 с 10%FPS на 500 микролитров трипсина для инактивации трипсина. Pipette вверх и вниз с P1000 набор на 500 микролитров по крайней мере 50 раз против стороны конической трубки для дальнейшей дезагрегации оставшихся сгустков в одиночные клетки. Поместите 40 микрон-клеточный ситечко над 50 миллилитровой конической трубки, и добавить один миллилитр передовых DMEM F-12 с 10%FPS, чтобы мокрые клетки ситечко.
Pipette одноклеточной подвески от 15 миллилитров conical на ситечко. Вымойте ситечко с одним миллилитров передовых DMEM F-12 с 10%FPS. Перенесите клетки, которые прошли через клеточный ситечко из 50 миллилитров конической трубки в новую 15 миллилитровую коническую трубку.
Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Центрифуга клетки в новой 15 миллилитровой трубки при 400G в течение пяти минут при комнатной температуре. Клеточные гранулы должны быть видны.
Аккуратно удалите супернатант пипеткой, снова сохранив супернатант в случае, если гранулы выбиты. Повторное производство клеточных гранул в MCMGF плюс с 10 микромоляной Y27632. Убедитесь, что ecM закодированные мембраны полностью высохли, как оценивается глазом.
Вымойте верхнюю камеру 200 микролитров MCMGF плюс. Затем добавьте 200 микролитров клеточного раствора в каждую верхнюю камеру. Добавьте 700 микролитров MCMGF плюс по 10 микромоляров Y27632 к каждой нижней палате.
Поместите пластину в инкубатор культуры тканей 37 градусов по Цельсию с 5%CO2. После одного дня роста, удалить средства массовой информации из верхней палаты, и заменить 200 микролитров свежих MCMGF плюс для предотвращения роста нескольких слоев клеток. После того, как монослойные примерно 80%confluent, как правило, между днями от одного до трех пост посева, заменить базилатеральных средств массовой информации с дифференциацией средств массовой информации для управления скважин, или с M сотовых средств массовой информации для индукционных скважин M клеток.
Замените средства массовой информации в верхней палате на средства дифференциации для обоих условий. Чтобы проверить дифференциацию ячеек M с помощью QRTPCR, сначала удалите мультимедиа из верхней и нижней камер. Аккуратно промойте верхнюю камеру дважды 300 микролитров комнатной температуры PPS.
Добавьте 300 микролитров TRIzol в каждую верхнюю камеру и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Между тем, этикетка микро центрифуги трубки для каждой хорошо, и добавить 700 микролитров TRIzol к каждой трубке. Соберите однородат клеток, аккуратно трубя вверх и вниз три раза с P1000, и передать содержимое в соответствующие микро центрифуги труб.
Vortex в течение пяти секунд, чтобы смешать. Храните образцы при комнатной температуре в течение еще трех минут, а затем продолжайте со стандартными протоколами RTPCR, или храните образцы при отрицательных 80 градусах по Цельсию. Для проверки дифференциации клеток M по иммунофлюоресценции, во-первых, удалить средства массовой информации из верхней палаты.
Аккуратно мыть два раза с 300 микролитров комнатной температуры PBS. Добавьте 100 микролитров комнатной температуры 4%PFA в PBS в верхнюю палату. Накройте тарелку фольгой и дайте постоять 25 минут при комнатной температуре.
После удаления PFA, мыть верхнюю камеру три раза с 300 микролитров комнатной температуры PBS. Инкубировать монослой с 100 микролитров 5%BSA растворяется в PBS в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре, чтобы заблокировать монослой перед удалением раствора. Подготовка GP2 первичного антитела решение в один процент BSA в PBS при разбавлении от одного до 100, и добавить 100 микролитров на колодец.
Пятно в течение одного часа при комнатной температуре в темноте, прежде чем удалить раствор. Вымойте верхнюю камеру три раза с 300 микролитров комнатной температуры PBS. Подготовь вторичное пятно раствор флуоресцентно помечены козы анти-мышь IgG фаллоидин и DAPI, и добавить 100 микролитров на колодец.
Пятно в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Вымойте скважины три раза с 300 микролитров PBS. Затем поместите на стеклянную горку пятилитровую каплю монтажного раствора.
Удалить хорошо из 24 хорошо пластины и инвертировать. Во время удаления мембраны из Трансвелла мембрана должна оставаться полностью плоской. Удары в мембране предотвращают твердое уплотнение стеклянной горки и могут сильно повлиять на качество изображения.
Чтобы обеспечить успех, осторожно вырежьте мембрану из колодец с помощью острого скальпеля. Поместите мембрану с клетками, обращенным вверх, на капельку монтажного раствора на стеклянной горке. Добавьте 10 микролитров монтажного раствора на верхнюю и центральную часть мембраны, а сверху поместите крышку, чтобы запечатать мембрану между стеклянной горкой и крышкой.
Высушите горки при комнатной температуре в темноте в течение 24 часов. М-клетки обнаруживаются поверхностным выражением GP2 иммунофлуоресцентными лампами. Как правило, в слиянии однослойных, от одного до пяти M клетки наблюдаются в данном поле микроскопа на 40X увеличение на дни от шести до восьми пост посева в образцах, обработанных RANKL и TNF альфа.
Выражение GP2 не видно в необработанных образцах. Ортогональный вид плоскости СЗ, наложенной фаллоидин-зондом, показывает актиновые структуры, окружающие каждую клетку, и выражение GP2 на апической поверхности клеток М. Эта модель резюмирует низкую частоту M-клеток, найденных в кишечнике человека.
Чтобы определить, если M клетки, разработанные в этой модели способны связываться с IgA, наличие IgA на клетках M визуализируется с помощью фтора конъюгированных вторичных антител, который распознает тяжелую цепь человеческой сыворотки IgA. M клетки, обработанные IgA в течение одного часа имеют IgA связаны с апической поверхности, в то время как M-клеток в контрольных скважин, которые были обработаны только вторичные антитела к IgA, не имеют обнаруживаемого сигнала. Кроме того, IgA специально связывается с апической поверхностью клеток M, и не найден связанным с любыми клетками, не имеющими пятна поверхности GP2.
Кроме того, M-клетки имеют характерно более короткий плотный актин на их апической поверхности. Переход на RANKL TNF альфа дополнены дифференциации средств массовой информации, когда монослойные около 80%confluent, является ключом к достижению хорошей дифференциации клеток M. Этот метод позволит исследователям исследовать вопросы, связанные с развитием клеток M, а также взаимодействия патогенов-хозяина и исследования транспортировки наркотиков с участием M-клеток.
