Borrelia — род спирохетных бактерий, который включает в себя три основных вида. Группа боррелиоза Лайма, группа возвратного тифа и менее хорошо охарактеризованная группа, обнаруженная у рептилий. Многие виды боррелий являются патогенными.
Культура бактерий является золотым стандартом для выявления инфекции. Это справедливо как для исследовательской, так и для клинической работы. Культура бактерий из жидкости и тканей организма подтверждает, что бактерии жизнеспособны и размножаются.
Этот протокол демонстрирует методологию и рецепты, необходимые для успешного культивирования и сохранения группы спирохет, вызванных боррелиозом Лайма, боррелиями возвратного тифа и Borrelia miyamotoi. Предложены методы культивирования ранее выделенных видов и штаммов, а также новых изолятов и моноклональных изолятов из источников окружающей среды или млекопитающих. Процедуру продемонстрируют Мари-Лайн Фосильон, научный сотрудник с докторской степенью, и Ингела Нильссон, техник из лаборатории Бергстрома, Анна Бертольд, научный сотрудник лаборатории Ллойда, и Марина Головченко, научный сотрудник лаборатории Руденко.
Для начала приобретите реагенты, необходимые для приготовления одного литра среды Барбары-Стоунер-Келли или BSK-II. Начните с растворения BSA в стакане, перемешивая воду. Затем добавьте все сухие химикаты и дайте им раствориться перед добавлением CMRL.
Отрегулируйте рН среды до 7,6. При необходимости используют один молярный гидроксид натрия. Затем добавьте кроличью сыворотку в среду до концентрации от шести до 10%Если рост бактерий не сильный, добавьте еще один к 2% сыворотки в среду.
Затем стерилизуют среду с помощью пористого фильтра 0,22 микрона. Заморозьте запас среднего в 100 или 400 миллилитровых аликвотах. Для штаммов возвратного тифа добавьте 100 миллилитров 7% стерильного желатина к 400 миллилитрам среды BSK-II.
Продезинфицируйте поверхность и все материалы 7%-ным этанолом и немедленно перенесите их в шкаф биологической безопасности. УФ-стерилизуют все небиологические материалы за пять минут до начала работы. Чтобы завести культуру, предварительно прогрейте среду в инкубаторе.
Затем добавьте один миллилитр размороженной культуры боррелий из глицеринового бульона в пять-15 миллилитров предварительно разогретой среды BSK. Заполните пробирки почти полностью, чтобы создать микро- или анаэробную атмосферу, прежде чем закрывать их. Выращивают виды возвратного тифа при температуре 37 градусов по Цельсию и виды Borrelia burgdorferi sensu lato при температуре от 33 до 34 градусов по Цельсию.
Следите за ростом культуры боррелий с помощью фазового контраста или микроскопии в темном поле при увеличении от 200 до 400 раз. Чтобы обеспечить равномерное распределение клеток, смешайте культуру серологической пипеткой или используйте трехмиллилитровую трансферную пипетку при пипетке вверх и вниз. Затем загрузите по 10 микролитров аликвоты культуры с каждой стороны гемоцитометра для подсчета.
Затем разбавьте экспоненциальную фазу культуры боррелий в соотношении один к двум или один к четырем со средой в пробирке объемом 1,7 миллилитра. При определении количества клеток учитывайте коэффициент разбавления. После использования опрыскайте на поверхности и гемоцитометр 10%-ный разбавленный отбеливатель и/или 70%-ный этанол.
Для экстракции ДНК или выделения клеток Borrelia центрифугируют экспоненциальную фазовую культуру в течение 10 минут при 4 000 G и выбрасывают надосадочную жидкость в подходящие биологически опасные отходы. Обработайте гранулированные бактерии с помощью коммерческого набора для экстракции ДНК или ресуспендируйте его в подходящей среде для предполагаемого эксперимента. В конце каждого эксперимента стерилизуйте все оборудование этанолом и УФ-излучением.
Соберите жидкие отходы, в том числе излишки культуры, в бутылку для отходов и добавьте 10% отбеливателя. Поставьте бутылку при температуре 80 градусов по Цельсию, прежде чем выбросить ее. Для длительного хранения культур Borrelia возьмите желаемый объем экспоненциальной фазовой культуры от 10 до 100 миллионов клеток на миллилитр, добавьте 10% стерильного глицерина и перемешайте пипеткой вверх и вниз.
Перелейте 1,5 миллилитра аликвот смеси в двухмиллилитровые криогенные флаконы с завинчивающейся крышкой. Храните флаконы с бульоном при температуре 80 градусов Цельсия. Держите запас не менее 10 тюбиков каждого штамма в морозильной камере, Чтобы культивировать боррелии от твердых клещей, собирайте взрослых самок, самцов и нимфальных клещей.
Поверхностно стерилизуйте клещей, погрузив их в 70% этанол на две минуты, и высушите на воздухе в шкафу биобезопасности. Далее рассекайте клещей по отдельности на несколько частей с помощью стерильного скальпеля. Затем поместите кусочки в двухмиллилитровую пробирку, содержащую 1,5 миллилитра среды с добавлением антибиотиков.
Инкубируйте культуры при температуре 34 градуса Цельсия и проверяйте наличие спирохет с помощью темнопольной или фазово-контрастной микроскопии два раза в неделю в течение первых двух недель и еженедельно после этого в течение шести недель. Чтобы культивировать боррелии из образцов крови, осторожно извлеките плазму из пробирки и инокулируйте один миллилитр плазмы в пять миллилитров предварительно нагретой модифицированной среды Келли-Петтенкофера или MKP Complete. Для культивирования боррелий из биопсии кожи поверхностно стерилизуют биопсию кожи 70% этанолом и перекисью водорода.
Затем поместите образец биопсии в физиологический раствор. Нарежьте образец кубиками на два-шесть меньших кусочков с помощью стерильного бритвенного лезвия в стеклянной чашке Петри, погруженной в физиологический раствор. Переложите нарезанный кубиками образец и один миллилитр физиологического раствора, в котором хранилась биопсия кожи, в пять миллилитров предварительно подогретой среды, дополненной антибиотиками, и инкубируйте при температуре 33 градуса Цельсия.
Для приготовления тарелок разогрейте 300 миллилитров среды 1,5x BSK или MKP Complete без желатина. Также подогрейте 200 миллилитров 1,7%-ной агарозы до 55 градусов по Цельсию. Смешайте жидкости и пипетку по 15 миллилитров на 16 глубоких чашах Петри, чтобы получился нижний слой агара.
Остаток средства выдержать на водяной бане. Количественно определите плотность культуры боррелий и разбавьте до желаемой плотности в жидкой среде. После того, как нижние пластины затвердеют, добавьте 10 миллилитров оставшейся смеси агара в качестве верхнего агара в 15-миллилитровую пробирку, содержащую соответствующее количество спирохет.
Вылейте суспензию на нижнюю тарелку с агаром в маркированную чашку Петри. После того, как пластины затвердеют, закройте их и поместите вверх дном при температуре от 34 до 35 градусов Цельсия в 2,5% углекислого газа. При правильном приготовлении среда БСК казалась красно-оранжевой и прозрачной.
Для сравнения здесь же показана неинокулированная среда МКП. Чрезмерный рост конкурирующих бактерий приводит к помутнению и слипанию материалов в среде. Рост бактерий контролировали путем визуального осмотра с помощью фазово-контрастной или темнопольной микроскопии.
В экспоненциальной фазе клетки боррелий, как правило, тонкие, изогнутые и в некоторой степени модальные. По мере того, как культуры вступают в стационарную фазу, круглые тела становятся все более очевидными. Клетки боррелий привередливы, и каждый вид, штамм и даже изолят различаются как генетически, так и благодаря адаптации к хозяину, от которого они были выделены.
При изготовлении среды соответствующие ингредиенты имеют огромное значение для жизнеспособности культуры боррелий или даже жизнеспособности культуры. Borrelia spirochetes сложно культивировать, но культивирование возможно. Культивирование в лаборатории является плацдармом для исследований биологии этих бактерий.
Культура предоставляет материал для понимания генома, протеома, эволюции и взаимодействия патогенов хозяина видов Borrelia. Культура боррелий может занять несколько недель, прежде чем спирохеты станут достаточно обильными для обнаружения. Это ограничивает возможности применения диагностики.
Но культура может показать, присутствуют ли виды боррелий, жизнеспособны и размножаются, и это может помочь получить доступ к лечению.
