Этот протокол подходит для производства очищенных дитерпеноидов, которые могут быть использованы для различных анализов вниз по течению и могут быть настроены для целого ряда различных целей метаболита. Основным преимуществом этого метода является простой и недорогой способ получения миллиграммов специализированных метаболитов. Путем обмена генами и ферментами, используемыми для совместного выражения, этот метод может быть изменен для производства других терпеноидов, в том числе монотерпеноидов и сесквитерпеноидов, а также других классов метаболита, таких как флавоноиды.
Для дитерпеноидов метаболического производства и трансформации, начните с потепления химически компетентных клеток E.coli на льду. Когда культура разморозится, добавьте 25 микролитров компетентных клеток на конструкцию в охлажденный микротрубок 1,5 миллилитров и добавьте 1 микролитр по 100 нанограмм на раствор микролитра каждой конструкции, используемой для совместного выражения. Инкубировать смеси на льду в течение 30 минут с нежным смешивания каждые 10 минут, соскоб труб через стойку микротрубки.
В конце инкубации тепло шокирует клеточные смеси при температуре 42 градуса по Цельсию в течение одной минуты, прежде чем поместить клетки обратно на лед еще как минимум на две минуты. Затем добавьте к трубам 200 микролитров 37 градусов по Цельсию. И инкубировать культуры в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию и 200 вращений в минуту.
В конце инкубации добавьте около 10 автоматических стеклянных бусин и 100 микролитров клеток к одному 37 градусам Цельсия, разогретому лизогенным бульоном агарной пластины с соответствующими антибиотиками. И встряхните пластину горизонтально с крышкой на месте, чтобы равномерно распределить клетки. Затем аккуратно коснитесь стеклянных бусин в мусорный контейнер и инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию на ночь, покрытием поверхности вниз.
На следующий день снимите тарелку с инкубатора. Добавьте 5 миллилитров свежеприготовленного лизогенного бульона среды с соответствующими антибиотиками в одну 15-миллилитровую стерильную стеклянную трубку с пластиковой дышащий крышкой на запланированный 1 литр культуры, и используйте наконечник трубы, чтобы выбрать отдельные преобразованные колонии E.Coli из агарной пластины. Добавьте одну выбранную колонию к каждой из подготовленных 15 миллилитровых трубок и крышка каждая трубка с сопровождающей дышащий пластиковый колпачок.
Затем поместите ограниченные E.coli малых культур в 37 градусов по Цельсию встряхивания инкубатор в течение 12 до 24 часов. На следующий день добавить 100 миллилитров 10x PBS до 900 миллилитров потрясающего бульона в 1 литровую колбу на небольшую культуру с соответствующими антибиотиками. И поместите колбы на 37 градусов по Цельсию и 140 оборотов в минуту в течение примерно 30 минут.
Когда потрясающий бульон теплый, добавьте весь 5 миллилитров объема каждой культуры прививки к одной 1 литровой культуре колбы на культуру. И поместите колбы в трясусь инкубатор на 140 оборотов в минуту в течение примерно 3 часов. Когда оптическая плотность на 600 нанометров достигнет 0,6, снизить температуру инкубатора до 16 градусов по Цельсию.
После того, как инкубатор остынет, добавьте 1 миллилитр одного молярного IPTG, 1 миллилитр свежеприготовленных 4 граммов на литр рибофлавина и 1 миллилитр свежеприготовленной 150 граммов на литр аминолевулиновой кислоты к каждой культуре. Для производства дитерпеноидов добавьте 25 миллилитров одного молярного пирувата натрия в каждую культуру, чтобы обеспечить достаточное образование прекурсоров. Затем инкубировать культуры при 16 градусах по Цельсию и 140 вращений в минуту в течение 72 часов, добавляя 25 миллилитров пирувата натрия ежедневно в соответствующие культуры.
Для разделения и очистки метаболита закрепните сепараторную воронку на кольцевой пододинке в дымовом капоте. И поместите контейнер для отходов под воронку. Налейте 500 миллилитров 50/50 раствора этилового ацетата и гексан в сепаральную воронку.
И добавить 500 миллилитров преобразованной культуры совместного выражения E.coli интереса в воронку. Поместите стеклянную пробку на воронку и встряхните воронку от 5 до 10 раз, чтобы смешать культуру с растворителем экстракции, часто открывая кран, в то время как воронка перевернута и навейте его в капот дыма, чтобы дегазать воронку. После второго раунда встряхивания и дегазаации, как только что продемонстрировано, поместите воронку вертикально в кольцо стоять около одной минуты.
Когда верхний слой растворителя отделился от аквеозного слоя культуры, удалите пробку и слейте слой E.coli в стакан отходов, сохраняя слой растворителя в воронке. Затем повторите экстракции с оставшимися 500 миллилитров культуры, используя те же 500 миллилитров растворителя, используемых для первой экстракции, прежде чем слить растворитель, содержащий извлеченные метаболиты в чистую колбу. Здесь показана наша репрезентативная газохроматография-масс-спектрометрия хроматограммы типичных извлеченных ферментных продуктов.
Обычно наблюдается незначительные побочные продукты включают хлорамфеникол и производные индола оксиндола и индола pivalaldehyde. После дитерпеноидной очистки с помощью кремнезема колонки хроматографии, три долабралексина соединений могут быть получены, как количественно на основе стандартной кривой с использованием дитерпеноидного sclareol. Крематография кремнезема идеально подходит для достижения высокой чистоты целевых соединений.
Так как он позволяет простой препарат дитерпен олефинов и оксигенированных производных и легко удаляет основные загрязняют оксиндол, который сохраняется на кремнезема матрицы. Кроме того, совместное выражение генов терпеноидного пути может быть использовано для производства дитерпеноидов в N.Benthamiana, в результате чего производство долабрадиена и 15, 16 эпоксидолабрена. Растворители, используемые во время экстракции, должны быть оптимизированы для физических химических свойств метаболитов, представляющих интерес, и не должны смешиваться с водой для поддержания двух различных слоев.
После этой процедуры, очищенные метаболиты могут быть использованы для анализа вниз по течению, в том числе структурного анализа и антибиотиков кислот. Этот метод позволил открытие новых дитерпеноидов, в том числе показанных здесь, что позволяет анализировать эти метаболиты для их химической структуры и новых биактивий. Примите меры предосторожности при использовании органических растворителей в сепараторной воронке.
Всегда будьте уверены, чтобы избавиться от биологических отходов в соответствии с вашими стандартами безопасности лаборатории.
