Рабдомиосаркома является редкой формой сарком мягких тканей, характеризующейся гистологически морфологией тканей и экспрессией миогенных маркеров. Однако, учитывая существование различных подтипов этих опухолей и неоднородность стимулов, способствующих его образованию, идентификация клетки происхождения была очень сложной задачей. Здесь мы описываем воспроизводимые и надежные методы идентификации клетки происхождения рабдомиосарком, начиная со свежеурожайных опухолевых тканей мышей, и этот анализ является анализом формирования опухолевой системы.
Основными преимуществами анализа формирования опухолевой системы является то, что она опирается на клеточные свойства, которые, как известно, присутствуют в опухолевых клетках, а также может быть использована для расширения и обогащения специфической клеточной популяции. Кроме того, его сфероидная структура имитирует опухоль окружающей среды, таким образом, они могут быть использованы в качестве наркотиков скрининга исследований. Этот метод имеет потенциал для применения к другим типа опухолей, поскольку он не требует предварительного знания молекулярных маркеров, но это может потребовать оптимизации культурных условий.
Tumorsphere может занять некоторое время, чтобы сформировать, особенно при попытке определить редкую популяцию клеток в вашей опухоли. Таким образом, не предлагается смотреть на вашу субкультуру пластины каждый день, так как это может негативно повлиять на результаты ваших экспериментов. Начните с разогрева 10-сантиметровой пластины с пятью миллилитров изоляционных средств массовой информации в инкубаторе при 37 градусах по Цельсию.
Взвесь от 500 до 1000 миллиграммов опухолевой ткани и поместите ее в тарелку. Принесите пластину с опухолевой тканью в стерильный вытяжку культуры и фарш его с лезвием бритвы. Для оптимального пищеварения убедитесь, что размеры фарша являются однородными.
Перенесите рубленую ткань и средства изоляции клеток в 15-миллилитровую центрифугу. Вымойте пластину еще четыре миллилитров средств массовой информации и добавить, что в трубку. Добавьте 700 единиц на миллилитр раствора коллагеназы в трубку и инкубировать его в трясущимся водяной бане при 37 градусах по Цельсию в течение 1 1/2 часов.
После инкубации, спина вниз ткани в 300 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре. Аспирировать супернатант, не нарушая гранулы, а затем повторно гранулы в 10 миллилитров второго раствора пищеварения и инкубировать в тряске водяной бане в течение еще 30 минут. После второго пищеварения, пипетка подвески клетки вверх и вниз и передать его через 70-микрометровый нейлоновый фильтр на 50-миллилитровой центрифуги трубки.
Затем промыть фильтр с 10 миллилитров клеточной изоляции средств массовой информации и спина вниз ткани в 300 раз г в течение пяти минут. Аспирировать супернатант и повторно помыть гранулы в 20 миллилитров опухолевых клеток. Перенесите подвеску на 15-сантиметровую культурную пластину и поместите клетки в инкубатор по Цельсию на 37 градусов по Цельсию на ночь.
На следующий день, изменить средства массовой информации для удаления мусора и мертвых клеток, которые могут негативно повлиять на выживание клеток. На данный момент, оценить слияние клеток и позволить клеткам расти в инкубаторе, пока он не достигнет 90%Мониторинг клеток каждый день и изменить средства массовой информации каждые два дня. Для получения опухолевых культур используйте клетки в Passage P1 или P2, чтобы избежать отбора клеток через несколько проходов.
Вымойте клеточное блюдо с PBS, а затем покрыть их раствором отряда. Поместите их в инкубатор на 5-10 минут, а затем подтвердите отрешенность, глядя на пластину под ярким микроскопом. После того, как клетки отсоединились, добавить опухолевые клетки к пластине и передать клеточной подвески в центрифугу трубки.
Спин клетки вниз на 300 раз г в течение пяти минут, удалить супернатант, и повторного перерасхода клеток в опухолевой сети. После повторного перерасхода клеток, подсчитайте их с помощью Trypan blue и вычислите концентрацию клеток. Плита надлежащее количество клеток в 96-ну низкой крепления пластины и поместить клетки в инкубатор до конца эксперимента, заботясь, чтобы не беспокоить пластины, если пополнение средств массовой информации.
После завершения эксперимента, определить tumorspheres вручную под ярким микроскопом или с помощью программного обеспечения Celigo. Количество и размер опухолевыхсфер могут быть оценены в результате этого анализа. Для подготовки опухолевыхсфер для трансплантации алотрансплантата, объединить все опухолевыесферы, полученные из определенного типа клеток или лечения.
Центрифуга опухолевыхсфер и тщательно удалить супернатант с помощью одномиллиметровой пипетки следуют 200-микролитр пипетки, а затем мыть их с 10 миллилитров стерильных PBS. Спин tumorspheres вниз снова и аспирировать PBS. Добавьте 500 микролитров в один миллилитр клеточного раствора отряда поверх гранул опухолевой сферы и инкубировать клетки в тряске водяной бани при 37 градусах по Цельсию.
Проверяйте прогрессирование пищеварения каждые 10 минут. Весь процесс занимает до 30 минут. Если переваривания опухолевой сферы в трясущимся водяной бане недостаточно для получения одноклеточного раствора, то предлагается механическое нарушение через трубы вверх и вниз.
Отметим, что после вращения опухолевыхсфер не образуются стабильные гранулы, поэтому аспирировать супернатант следует осторожно с помощью одноми миллилитровой пипетки и 200-микролитровых пипеток. Как только одноклеточный раствор получен, добавьте объем средств массовой информации опухолевых клеток и вращайте его вниз при 300 раз g в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия. После этой центрифугации все последующие шаги должны быть выполнены на льду.
Resuspend клетки в холодных средствах клетки тумора и подсчитывают живые клетки используя исключение голубого Trypan. Определите правильное количество клеток для алотрансплантата и разбавьте его в 50 микролитров холодного опухолевых клеток. Поместите наконечник пипетки в холодных опухолевых клеточных сми, чтобы охладить его, а затем использовать его, чтобы взять 50 микролитров холодного раствора ECM и добавить его в трубку с клетками, убедившись, что не удалить трубку ECM из льда во время этого процесса.
Поддерживайте клетки на льду до трансплантации и поместите на лед ограниченный 0,5-миллилитровый инсулиновый шприц с 29-го калибра иглы. После подтверждения того, что мышь была надлежащим образом анестезирована, побрить правую сторону животного, аспирировать клеточный раствор в охлажденный шприц, и вводить клетки подкожно в бритой области. Если инъекция выполняется правильно, под кожей сформируются видимые шишки.
Этот протокол может быть использован для надежной формы опухолевыхсфер для идентификации редких популяций клеток, которые отвечают за развитие саркомы мягких тканей. Фундаментальной частью этого анализа является дискриминация между опухолевыми и клеточными кластерами, которые демонстрируют явные морфологические различия. Чтобы определить оптимальную концентрацию, при которой белок интереса вызывает воздействие на опухолевые клетки, необходимо оценить уровень экспрессии целей белка ниже по течению.
Три из проверенных генов показали дозозависимый ответ на рекомбинантное лечение белка, а один нет. Для установления эффективного протокола были проанализированы эффекты трансфекции на врожденные опухолевые клетки; было протестировано два различных количества реагента и оценена эффективность с помощью плазмиды GFP-репортера. Снижение количества реагентов привело к повышению эффективности трансфекции.
Для выполнения трансфекции на ячейках подвески должен был быть внедрен двухшаговой протокол. Трансфекция была проведена на адепт-клеток и 24 часов спустя они были отделены и потрошены в подвеске; после семи дней, контролируемые опухолевыесферы выражали GFP. После получения, лечения и трансплантации опухолей можно сравнить эффект этого различного лечения при росте опухоли in vivo.
Эти методы позволят ученым ответить на все еще стоящие вопросы клетки происхождения рабдомиосарком и в то же время засовытить основу для скрининга наркотиков.
