Высокое разрешение изображения одиночных синапсов, выражаюющих быстрый датчик глутамата, позволяет обнаруживать локальное несоответствие между высвобождением передатчика и поглощением. В случае заболевания, этот метод может быть использован для выявления дисфункциональных синапсов. Для коррекции аутофторесценции, во-первых, поместите кусочек мозга из мыши, представляющих интерес, в камеру записи однофотографного микроскопа.
Погрузите кусочек в кислородом, искусственной спинномозговой жидкости и использовать 20x воды погружения цели, чтобы найти спинной стриатум. Исправить ломтики с нейлоновой сетки на платиновой арфы, чтобы свести к минимуму движение ткани, и переключиться на 63x воды погружения цели. Используя фильтр высокого прохода на 510 нанометров, приобретайте изображение положительных структур датчика аутофторесцентного и глутамата.
Используя фильтр высокого прохода на 600 нанометров, приобрести второе изображение автофлюоресцентных структур в одиночку. Чтобы определить диапазон, используйте средние интенсивности 10 самых ярких и 10 самых темных пикселей для масштабирования красных и желтых изображений. Затем выполните вычитание желтого минус красного изображения и перемасштабировуйте вычитаемое изображение для создания стандартного 8-битного файла TIFF для удобной визуализации ботона интереса.
Для выполнения поиска отзывчивых бутонов, вам нужен подходящий стеклянный микропипют для электрической стимуляции. Используйте шкив micropipette для того чтобы произвести пипетки стимуляции от borosilicate стеклянных капилляров с внутренними диаметрами кончика около одного микрометра. Для зондирования для действий потенциально зависимого выпуска глутамата из набора кандидатов бутонов, выберите 63x увеличение и 510 нанометрового фильтра выбросов.
Загрузите вычитаемое изображение, чтобы обеспечить размещение электрода стимуляции стекла рядом с флуоресцентной изменчивостью, избегая близости дополнительных аксонов. В какой изменчивости, связанные с максимальной бифуркации или распределения в более глубокой части среза. Поместите электрод стимуляции рядом с бойоном интереса и выключите свет, так как записи должны быть выполнены в полной темноте.
Затем включите многоканальную систему применения ванны, при этом один канал поставляет стандартный раствор ванны, а другие каналы доставляют необходимые блокаторы ионных каналов, транспортеров или мембранных рецепторов, включая тетрототоксин для блокирования потенциальной генерации действия. Контролировать поток в месте записи и включить стимулятор для доставки деполяризации тока импульсов от двух до 10 микроампер для стимуляции пипетки. Выпуск теперь активируется прямым притоком кальция через закрытые каналы напряжения.
Чтобы визуализировать высвобождение глутамата в клиренс, используя микроскоп X, Y диски, место испытания датчика глутамата положительный бутон близко к центру поля зрения. После остановки приобретения нажмите на изображение левой кнопкой мыши, чтобы определить положение X, Y в центре отдыха. Будут отображаться координаты X, Y курсора набора.
Используя данные калибровки, вычислите координаты места, куда лазерный луч должен быть отправлен для возбуждения флуоресценции датчика глутамата, используя указанные формулы. Чтобы создать последовательность одной точки в программном обеспечении лазерного управления, выберите точку в поле добавления к последовательности на странице последовательности программного обеспечения лазерного управления и установите запуски и запуск задержки до нуля, и последовательность для запуска на TLL. Затем щелкните последовательность запуска.
В программном обеспечении управления камерой выберите соответствующие параметры изображения и выберите внешний старт для триггерного режима. Нажмите принять сигнал в программном обеспечении управления камерой. Затем инициировать экспериментальный протокол, изложенный для триггерного устройства, и реализовать экспериментальное испытание протокола с соответствующей временной шкалой, так что камера будет приобретать 400 кадров с частотой 2,48 килогерца во время одного испытания, с 0,1 герц или ниже частоты повторения.
Для выявления патологических синапсов включите режим высоты и рассчитайте интенсивность флуоресценции, среднее и стандартное отклонение для выбранной области интереса в состоянии покоя. Определите и коробите область, занятую пикселями с интенсивностью флуоресценции в покое, больше, чем среднее плюс три стандартных отклонения, и определите виртуальный диаметр микронов, предполагая круговую форму области надпого порога. Участок флуоресценции интенсивности со временем, как разница между фактическим значением интенсивности флуоресценции и значение интенсивности флуоресценции в покое делится на значение интенсивности флуоресценции в покое.
Определите пиковую амплитуду реакции на флуоресценцию. Выполните моноэкспонентную установку для распада с пика реакции флуоресценции и определите время постоянного распада, TauD. Для оценки максимальной амплитуды при данной синапсе выберите пиксель с наибольшим изменением интенсивности флуоресценции, что является лучшим показателем нагрузки глутамата, представленной механизму очистки синапса.
Одноразовая синапсовая визуализация может быть использована для определения двух классов кортикостриатальных синапсов с использованием критериев соотношения размера и парного импульса. С интервалом в 20-50 миллисекунд меньшие межэнтерохефалические терминалы подвержены парной депрессии пульса, в то время как более крупные терминалы пирамидального тракта показали парное упрощение пульса. Тесты на моторное поведение, выполняемые на мышах дикого типа и мышах, выражающихся фенотип Хантингтона, показывают значительное положительное coorelation между результатами, полученными для общего пути запустить в открытом поле, и шаг за задержкой.
Кроме того, один синапс глутамат изображений показывает, что симптоматические мыши Хантингтон выставлены дефицит скорости juxtasynpatic глутамат распада, как это отражено в Значениях TauD глутамата ответы на одну стимуляцию синапса. У диких животных такое пролонгация наблюдалось только после применения селективного, не транспортируемого ингибитора поглощения глутамата. Оценка вероятности возникновения данного значения TauD в ломтиках от диких мышей, и мышей, выражающихся симптомы болезни Хантингтона, показали, что у диких животных, TauD никогда не превышает 15 миллисекунд.
В симптоматической болезни Хантингтона однако, 40% синапсов экспонат TauD значения между 16 и 58 миллисекунд, несмотря на тенденцию к сокращению количества выпущенного глутамата. Таким образом, TauD может рассматриваться как биомаркер для дисфункциональных синапсов при болезни Хантингтона, и может быть дополнительно использован для проверки функционального восстановления в экспериментах, направленных на астроцитатический глутамат транспорта. Этот протокол для мониторинга глутамата в отдельных кортикостриатальных синапсов может помочь прояснить роль дефицита поглощения глутамата в патогенеза нейродегенеративных заболеваний.
Однократная синапсовая визуализация особенно полезна для изучения досинаптических участков возбуждающих синапсов.
