빠른 글루타메이트 센서를 표현하는 단일 시냅스의 고해상도 이미징을 통해 송신기 방출과 섭취 사이의 로컬 불일치를 감지할 수 있습니다. 질병의 경우,이 방법은 기능 장애 시냅스를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 자동 발광 보정을 위해 먼저 관심있는 마우스에서 뇌 조각을 한 광자 현미경의 기록 챔버에 놓습니다.
산소, 인공 뇌척수액에 슬라이스를 침수하고 등쪽 striatum을 찾기 위해 20 배 물 침수 목표를 사용합니다. 백금 하프에 나일론 그리드로 슬라이스를 고정하여 조직의 움직임을 최소화하고 63배의 수분 침수 목표로 전환합니다. 510 나노미터의 하이 패스 필터를 사용하여 자동 형광 및 글루타민트 센서 양성 구조의 이미지를 함께 획득합니다.
600 나노미터의 하이 패스 필터를 사용하여 자동 형광 구조의 두 번째 이미지를 단독으로 획득하십시오. 범위를 정의하려면 10개의 가장 밝은 픽셀과 10개의 어두운 픽셀의 평균 강도를 사용하여 빨간색과 노란색 이미지를 배율조정합니다. 그런 다음, 노란색 마이너스 빨간색 이미지의 빼기를 수행하고 빼기 된 이미지를 다시 조정하여 관심있는 bouton의 편리한 시각화를 위해 표준 8 비트 TIFF 파일을 생성합니다.
반응성 부폰을 검색하려면 전기 자극에 적합한 유리 마이크로 파이프가 필요합니다. 마이크로피펫 풀러를 사용하여 약 1 마이크로미터의 내부 팁 직경을 가진 보로실리케이트 유리 모세 혈관에서 자극 파이펫을 생성합니다. 후보 부톤 세트에서 글루타메이트의 작용 잠재력 에 따라 방출을 조사하려면 63x 배율 및 510 나노미터 방출 필터를 선택합니다.
감산 된 이미지를적재하여 형광 실도 옆에 유리 자극 전극을 배치하여 추가 축축의 근접성을 피합니다. 슬라이스의 깊은 부분 내에서 최대 분기 또는 할당과 관련된 점만도 있습니다. 녹음은 완전한 어둠 속에서 수행되어야하므로 자극 전극을 관심의 부톤 근처에 놓고 빛을 끕니다.
그런 다음, 다중 채널 목욕 응용 시스템을 켜고, 하나의 채널은 표준 목욕 용액을 제공하고 다른 채널은 작용 잠재적 생성을 차단하는 테트로톡신을 포함하여 이온 채널, 수송기 또는 멤브레인 수용체의 필요한 차단제를 제공합니다. 레코딩 부위의 흐름을 제어하고 자극기를 켜서 자극 파이펫에 2 내지 10 마이크로앰프의 탈극전류 펄스를 전달한다. 이제 방출은 전압 게이트 채널을 통해 직접 칼슘 유입에 의해 활성화됩니다.
글루타민제 방출을 클리어런스에서 시각화하려면 현미경 X, Y 드라이브를 사용하여 테스트된 글루타메이트 센서 양성 부폰을 뷰필드 센터 가까이에 배치합니다. 획득을 중지한 후 왼쪽 마우스 버튼으로 이미지를 클릭하여 나머지 부튼 센터의 X, Y 위치를 결정합니다. 세트 커서의 X, Y 좌표가 표시됩니다.
교정 데이터를 사용하여, 레이저 빔이 표시된 대로 수식을 사용하여 글루타민트 센서 형광의 흥분을 위해 전송되어야하는 사이트의 좌표를 계산합니다. 레이저 제어 소프트웨어에서 1점 시퀀스를 만들려면 레이저 제어 소프트웨어의 시퀀스 페이지에서 시퀀스 박스에 추가점을 선택하고 실행 및 실행 지연을 0으로 설정하고 TLL에서 실행되는 시퀀스를 설정합니다. 그런 다음 시작 시퀀스를 클릭합니다.
카메라 제어 소프트웨어에서 적절한 이미징 매개 변수를 선택하고 트리거 모드의 외부 시작을 선택합니다. 카메라 제어 소프트웨어에서 신호를 클릭합니다. 그런 다음 트리거 장치에 대해 배치된 실험 프로토콜을 시작하고 적절한 타임라인으로 실험 프로토콜 시험을 구현하여 카메라가 한 번의 시험 중에 2.48킬로헤르츠 주파수로 400프레임을 획득하고 0.1 헤르츠 또는 더 낮은 반복 주파수를 가진다.
병리학적 시냅스를 식별하려면 고도 루틴을 켜고 선택한 관심 지역에 대한 형광 강도, 평균 및 표준 편차를 계산합니다. 평균보다 3개의 표준 편차가 큰 휴식시 형광 강도가 있는 픽셀에 의해 점유된 영역을 결정하고 상자에 보관하고, 슈프라 임계값 영역의 원형 형태를 가정하는 미크론의 가상 직경을 결정한다. 실제 형광 강도 값과 나머지의 형광 강도 값 사이의 차이로 시간에 대한 형광 강도를 플롯나머지형 강도 값으로 나눈다.
형광 반응의 피크 진폭을 결정합니다. 형광 반응의 피크에서 부패에 대한 단일 exponential 피팅을 수행하고, 부패, TauD의 시간 상수를 결정합니다. 주어진 시냅스에서 최대 진폭을 추정하려면 형광 강도가 가장 높은 픽셀을 선택하여 시냅스의 클리어런스 기계에 제시된 글루타민트 부하의 가장 좋은 지표입니다.
단일 시냅스 이미징은 크기와 페어링된 펄스 비율 기준을 사용하여 두 종류의 코르티코스테리탈 시냅스를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 20~50밀리초의 자극 간격에서, 더 작은 인터테로치팔릭 단자는 맥박 우울증을 짝을 이루는 경향이 있고, 더 큰 피라미드 경하 단자는 짝을 이루는 펄스 촉진을 보였다. 헌팅턴 표현형을 발현하는 야생형 마우스와 마우스에서 수행된 모터 거동에 대한 테스트는, 개방된 필드에서 의 총 경로 실행에 대해 얻은 결과 와 대기 시간 보다 단계 사이의 상당한 양성 쿠관계를 나타낸다.
또한, 단일 시냅스 글루타민트 이미징은 증상 헌팅턴 마우스가 단일 시냅스 자극에 대한 글루타민반응의 TauD 값에 반영된 병타신박식 글루타메이트 부패의 속도로 적자를 나타냈다는 것을 보여준다. 야생 형 동물에서, 이러한 연장은 조미료 섭취의 선택적, 비 운반 억제제의 적용 후에만 관찰되었다. 야생형 마우스의 슬라이스에서 주어진 TauD 값의 발생 확률과 헌팅턴 병의 증상을 표현하는 쥐의 평가에 따르면 야생 동물에서는 TauD가 15밀리초를 초과하지 않는 것으로 나타났습니다.
그러나 증상 헌팅턴병에서는 시냅스의 40%가 16~58밀리초 사이의 TauD 값을 나타내지만, 방출된 글루타민트의 양이 감소하는 경향에도 불구하고. 따라서, TauD는 헌팅턴병에서 기능성 시냅스를 위한 바이오마커로 간주될 수 있고, 성상세포 글루타민산염 수송을 표적으로 하는 실험에서 기능적 회복을 확인하는 데 더 사용될 수 있다. 개별 corticostriatal 시냅스에서 글루타민트 모니터링을 위한 이 프로토콜은 신경 퇴행성 질병의 병인에 있는 글루타민자 섭취 결핍의 역할을 명확히 하는 것을 도울 수 있습니다.
단일 시냅스 이미징은 흥분 시냅스의 사전 합성 부위를 탐색하는 데 특히 유용합니다.
