L'imaging ad alta risoluzione di singole sinapsi che esprimono un sensore di glutammato veloce consente di rilevare la mancata corrispondenza locale tra il rilascio del trasmettitore e l'assorbimento. Nel caso della malattia, questo metodo può essere utilizzato per identificare sinapsi disfunzionali. Per la correzione dell'autofluorescenza, in primo luogo, posizionare una fetta cerebrale dal mouse di interesse nella camera di registrazione di un microscopio con un fotone.
Immergere la fetta in liquido cerebrospinale ossigenato e artificiale e utilizzare l'obiettivo 20x di immersione in acqua per localizzare lo striato dorsale. Fissare le fette con una griglia di nylon su un'arpa di platino per ridurre al minimo il movimento del tessuto e passare all'obiettivo 63x di immersione in acqua. Utilizzando un filtro passa alto a 510 nanometri, acquisire un'immagine delle strutture positive del sensore autofluorescente e glutammato insieme.
Utilizzando un filtro passa alto a 600 nanometri, acquisire una seconda immagine delle sole strutture autofluorescenti. Per definire l'intervallo, usate le intensità medie dei 10 pixel più luminosi e 10 più scuri per ridimensionare le immagini rosse e gialle. Quindi, eseguire una sottrazione dell'immagine gialla meno rossa e ridimensionare l'immagine sottratta per generare un file TIFF standard a 8 bit per una comoda visualizzazione del bouton di interesse.
Per eseguire una ricerca di bouton reattivi, è necessaria una micropipetta di vetro adatta per la stimolazione elettrica. Utilizzare un estrattore di micropipette per produrre pipette di stimolazione da capillari in vetro borosilicato con diametri di punta interni di circa un micrometro. Per sondare il potenziale rilascio dipendente di glutammato da una serie di bouton candidati, selezionare un ingrandimento 63x e un filtro di emissione da 510 nanometri.
Caricare l'immagine sottratta per consentire il posizionamento di un elettrodo di stimolazione del vetro accanto a una varicosità fluorescente, evitando la vicinanza di assoni aggiuntivi. In quali variacosità associate a una massima biforcazione o allocazione all'interno di una parte più profonda della fetta. Posizionare l'elettrodo di stimolazione vicino al bouton di interesse e spegnere la luce, poiché le registrazioni devono essere eseguite in completa oscurità.
Quindi, accendi il sistema di applicazione del bagno multicanale, con un canale che fornisce la soluzione da bagno standard e gli altri canali che forniscono i blocchi necessari dei canali ionici, dei trasportatori o dei recettori a membrana, inclusa la tetrototossina per bloccare la potenziale generazione di azione. Controllare il flusso nel sito di registrazione e accendere lo stimolatore per fornire impulsi di corrente depolarizzante da due a 10 microambi alla pipetta di stimolazione. Il rilascio è ora attivato dall'afflusso diretto di calcio attraverso canali gated di tensione.
Per visualizzare il rilascio di glutammato nel gioco, utilizzando le unità X, Y del microscopio, posizionare il bouton positivo del sensore di glutammato testato vicino al centro del campo visivo. Dopo aver interrotto l'acquisizione, fare clic sull'immagine con il pulsante sinistro del mouse per determinare la posizione X, Y del centro bouton a riposo. Verranno visualizzate le coordinate X, Y del cursore impostato.
Utilizzando i dati di calibrazione, calcolare le coordinate del sito in cui deve essere inviato il raggio laser per l'eccitazione della fluorescenza del sensore di glutammato utilizzando le formule indicate. Per creare una sequenza di un punto nel software di controllo laser, selezionare il punto nella casella aggiungi alla sequenza nella pagina di sequenza del software di controllo laser e impostare le esecuzioni e il ritardo di esecuzione su zero e la sequenza da eseguire a TLL. Quindi, fare clic su sequenza iniziale.
Nel software di controllo della fotocamera, selezionare i parametri di imaging appropriati e selezionare l'avvio esterno per la modalità trigger. Fare clic su prendi segnale nel software di controllo della fotocamera. Quindi, avviare il protocollo sperimentale previsto per il dispositivo trigger e implementare lo studio sperimentale del protocollo con la timeline appropriata, in modo che la fotocamera acquisisca 400 fotogrammi con una frequenza di 2,48 kilohertz durante una prova, con una frequenza di ripetizione di 0,1 hertz o inferiore.
Per identificare le sinapsi patologiche, attivare le routine di elevazione e calcolare l'intensità della fluorescenza, la media e la deviazione standard per la regione di interesse selezionata a riposo. Determinare e boxare l'area occupata da pixel con un'intensità di fluorescenza a riposo maggiore della media più tre deviazioni standard, e determinare un diametro virtuale in micron assumendo una forma circolare dell'area di soglia sopra. Tracciare l'intensità della fluorescenza rispetto al tempo, come differenza tra il valore effettivo dell'intensità di fluorescenza e il valore di intensità della fluorescenza a riposo diviso per il valore di intensità della fluorescenza a riposo.
Determinare l'ampiezza di picco della risposta di fluorescenza. Eseguire un raccordo monoesoderenziale per il decadimento dal picco della risposta di fluorescenza e determinare la costante di tempo di decadimento, TauD. Per stimare l'ampiezza massima ad una data sinapsi, selezionare il pixel con la più alta variazione di intensità di fluorescenza, che è il miglior indicatore del carico di glutammato presentato alla macchina di gioco della sinapsi.
L'imaging a sinapsi singola può essere utilizzato per identificare due classi di sinapsi corticostriali utilizzando i criteri di dimensione e rapporto impulso accoppiato. A intervalli di stimolo da 20 a 50 millisecondi, i terminali interenterochefalici più piccoli sono soggetti a depressione dell'impulso accoppiata, mentre i terminali del tratto piramidale più grandi hanno mostrato una facilitazione dell'impulso accoppiata. I test sul comportamento motorio eseguiti su topi e topi di tipo selvatico che esprimono un fenotipo Huntington, rivelano una significativa coorelazione positiva tra i risultati ottenuti per il percorso totale eseguito nel campo aperto e il passaggio oltre la latenza.
Inoltre, l'imaging del glutammato a sinapsi singola mostra che i topi Huntington sintomatici mostravano un deficit nella velocità di decadimento del glutammato giustanosi come riflesso nei valori taud delle risposte del glutammato alla stimolazione della singola sinapsi. Negli animali di tipo selvatico, tale prolungamento è stato osservato solo dopo l'applicazione di un inibitore selettivo e non trasportabile dell'assorbimento del glutammato. La valutazione della probabilità di insorgenza di un dato valore di TauD in fette di topi di tipo selvatico, e topi che esprimono i sintomi della malattia di Huntington, ha rivelato che negli animali di tipo selvatico, TauD non supera mai i 15 millisecondi.
Nella malattia sintomatica di Huntington, tuttavia, il 40% delle sinapsi mostra valori di TauD tra 16 e 58 millisecondi, nonostante la tendenza alla riduzione della quantità di glutammato rilasciato. Pertanto, il TauD potrebbe essere considerato un biomarcatore per le sinapsi disfunzionali nella malattia di Huntington, e può essere ulteriormente utilizzato per verificare il recupero funzionale in esperimenti mirati al trasporto di glutammato astrocitico. Questo protocollo per il monitoraggio del glutammato nelle singole sinapsi corticostriali può aiutare a chiarire il ruolo della carenza di assorbimento del glutammato nella patogenesi della malattia neurodegenerativa.
L'imaging a sinapsi singola è particolarmente utile per esplorare siti pre-sinaptici di sinapsi eccitatorie.
