Hızlı glutamat sensörünü ifade eden tek sinapsların yüksek çözünürlüklü görüntülemesi, verici salınımı ve alımı arasındaki yerel uyumsuzluğun algılanmasını sağlar. Hastalık durumunda, bu yöntem işlevsiz sinapsları tanımlamak için kullanılabilir. Otofloresan düzeltme için, ilk olarak, tek foton mikroskobun kayıt odasına ilgi farebir beyin dilimi yerleştirin.
Oksijenli, yapay beyin omurilik sıvısı dilim batırın ve dorsal striatum bulmak için 20x su daldırma hedefi kullanın. Doku hareketini en aza indirmek için bir platin arp üzerinde bir naylon ızgara ile dilimleri düzeltmek ve 63x su daldırma hedefine geçin. 510 nanometre yüksek geçiş filtresi kullanarak, birlikte otofloresan ve glutamat sensörü pozitif yapıların bir görüntü elde.
600 nanometre yüksek geçiş filtresi kullanarak, tek başına otofloresan yapıların ikinci bir görüntü elde. Aralığı tanımlamak için, kırmızı ve sarı görüntüleri ölçeklendirmek için en parlak ve 10 en koyu pikselin ortalama yoğunluklarını kullanın. Ardından, sarı eksi kırmızı görüntünün bir çıkarını gerçekleştirin ve çıkarbouton'un uygun görselleştirilmesi için standart bir 8 bit TIFF dosyası oluşturmak için çıkarılan görüntüyü yeniden ölçeklendirin.
Duyarlı boutons için bir arama yapmak için, elektrik stimülasyon için uygun bir cam mikropipet gerekir. Yaklaşık bir mikrometre iç uç çapları ile borosilikat cam kılcal damarlar stimülasyon pipetler üretmek için bir mikropipet puller kullanın. Bir dizi aday bouton'dan glutamatın eylem potansiyeline bağımlı salınımını araştırmak için 63x büyütme ve 510 nanometre emisyon filtresi seçin.
Ek aksonların yakınlığından kaçınarak, bir cam stimülasyon elektrotunun floresan varisin yanına yerleştirilmesine izin vermek için çıkarılan görüntüyü yükleyin. Dilimin daha derin bir parçası içinde maksimum çatallanma veya ayırma ile ilişkili ne varicosities. Stimülasyon elektrotunu ilgi nöbetinin yakınına yerleştirin ve kayıtların tamamen karanlıkta yapılması gerektiğinden ışığı kapatın.
Daha sonra, standart banyo solüsyonu ve iyon kanalları, taşıyıcılar veya membran reseptörlerinin gerekli blokerler teslim diğer kanallar, eylem potansiyel nesil engellemek için tetrototoksin dahil olmak üzere teslim ile, çok kanallı banyo uygulama sistemi açın. Kayıt yerindeki akışı kontrol edin ve stimülasyon pipetesine iki ila 10 mikroamp'ın depolarize akım darbeleri sunmak için uyarıcıyı açın. Serbest bırakma şimdi voltaj kapılı kanallar aracılığıyla doğrudan kalsiyum akını ile aktive edilir.
Mikroskop X, Y sürücüleri kullanarak, açıklık glutamat serbest görselleştirmek için, viewfield merkezine yakın test glutamat sensörü pozitif bouton yerleştirin. Kazanımı durdurduktan sonra, dinlenme bouton merkezinin X, Y konumunu belirlemek için sol fare tuşu ile görüntünün üzerine tıklayın. Kümeimlecinin X, Y koordinatları görüntülenir.
Kalibrasyon verilerini kullanarak, lazer ışınının glutamat sensörü floresanuyarılması için gönderilmesi gereken yerin koordinatlarını belirtildiği gibi formüller kullanarak hesaplayın. Lazer kontrol yazılımında bir nokta sırası oluşturmak için, lazer kontrol yazılımının sıra sayfasındaki ekle ekle kutusundaki noktayı seçin ve çalıştırma ve çalıştırma gecikmesini sıfıra, sırayı da TLL'de çalıştırın. Ardından başlat dizisini tıklatın.
Kamera kontrol yazılımında, uygun görüntüleme parametrelerini seçin ve tetik modu için harici başlatmayı seçin. Kamera kontrol yazılımında sinyal almak'ı tıklatın. Ardından, tetikleme aygıtı için belirlenen deneysel protokolü başlatın ve kameranın bir deneme sırasında 2,48 kilohertz frekansı olan 400 kare yi 0,1 hertz veya daha düşük tekrarlama frekansıyla elde edilebilmeleri için uygun zaman çizelgesi ile deneysel protokol denemesini uygulayın.
Patolojik sinapsları belirlemek için, yükseklik rutinlerini açın ve seçilen dinlenme alanı için floresan yoğunluğunu, ortalamasını ve standart sapmasını hesaplayın. Ortalama artı üç standart sapmadan daha büyük bir floresan yoğunluğuna sahip piksellerin işgal ettiği alanı belirleyin ve kutulayın ve supra eşik alanının dairesel bir biçimini varsayarak mikronlarda sanal çapı belirleyin. Gerçek floresan yoğunluk değeri ile geri kalan floresan yoğunluk değeri arasındaki fark, floresan yoğunluğu değeri ile istirahatte floresan yoğunluk değerine bölündüğü için floresan yoğunluğunu zamana göre çizin.
Floresan yanıtının en yüksek genliğini belirleyin. Floresan tepkisinin zirvesinden çürüme için monokonsital bir uyum gerçekleştirin ve çürüme, TauD zaman sabitini belirlemek. Belirli bir sinapstaki maksimal genliği tahmin etmek için, floresan yoğunluğunda en yüksek değişikliğe sahip pikseli seçin, bu da sinapsın temizleme makinesine sunulan glutamat yükünün en iyi göstergesidir.
Tek sinaps görüntüleme boyutu ve eşleştirilmiş nabız oranı kriterleri kullanılarak kortikotorital sinapsların iki sınıf ını tanımlamak için kullanılabilir. 20 ila 50 milisaniye uyarıcı aralıklarla, küçük interenterochephalic terminalleri eşleştirilmiş nabız depresyoneğilimli, büyük piramit yol terminalleri eşleştirilmiş darbe kolaylaştırma gösterdi. Huntington fenotipini ifade eden vahşi tip fareler ve fareler üzerinde yapılan motor davranışlar üzerinde yapılan testler, açık alanda toplam yol çalışması için elde edilen sonuçlar ile gecikmenin üzerinden bir adım arasında anlamlı bir pozitif coorelation ortaya koymaktadır.
Ayrıca, tek sinaps glutamat görüntüleme semptomatik Huntington fareler tek sinaps stimülasyonu glutamat yanıtlarının TauD değerlerinde yansıtılır gibi yan yana glutamat çürüme hızında bir açık sergiledi gösterir. Vahşi tip hayvanlarda, bu uzama sadece glutamat alımının seçici, taşınamayan inhibitörü uygulamasından sonra gözlenmiştir. Yabani tip farelerve Huntington hastalığının belirtilerini ifade eden farelerden belirli bir TauD değerinin oluşma olasılığının değerlendirilmesi, yabani hayvanlarda TauD'un asla 15 milisaniyeyi geçmeyeceğini ortaya koymuştur.
Ancak semptomatik Huntington hastalığında sinapsların %40'ı, serbest bırakılan glutamat miktarında azalma eğilimine rağmen 16 ile 58 milisaniye arasında TauD değerleri gösterir. Bu nedenle, TauD Huntington hastalığında işlevsiz sinapslar için bir biyomarker olarak kabul edilebilir, ve daha fazla astrositik glutamat taşıma hedefleyen deneylerde fonksiyonel iyileşme doğrulamak için kullanılabilir. Bireysel kortikotot sinapslarında glutamat takibi için bu protokol nörodejeneratif hastalığın patogenezinde glutamat alımı eksikliğinin rolünü açıklığa kavuşturmaya yardımcı olabilir.
Tek sinaps görüntüleme özellikle uyarıcı sinapsların pre-sinaptical sitelerini keşfetmek için yararlıdır.
