Imagens de alta resolução de sinapses únicas expressando um sensor de glutamato rápido permitem uma detecção de incompatibilidade local entre a liberação do transmissor e a absorção. No caso da doença, este método pode ser usado para identificar sinapses disfuncionais. Para correção de autofluorescência, primeiro, coloque uma fatia cerebral do rato de interesse na câmara de gravação de um microscópio de um fóton.
Submergir a fatia em fluido cerebrospinal oxigenado e artificial e usar o objetivo de imersão de água de 20x para localizar o estriado dorsal. Fixar as fatias com uma grade de nylon em uma harpa de platina para minimizar o movimento do tecido e mudar para o objetivo de imersão em água de 63x. Usando um filtro de passagem alta a 510 nanômetros, adquira uma imagem das estruturas positivas do sensor autofluorescente e glutamato.
Usando um filtro de passagem alta a 600 nanômetros, adquira uma segunda imagem apenas das estruturas autofluorescentes. Para definir o alcance, use as intensidades médias dos 10 pixels mais brilhantes e 10 mais escuros para dimensionar as imagens vermelhas e amarelas. Em seguida, realize uma subtração da imagem amarela menos vermelho e redimensione a imagem subtraída para gerar um arquivo TIFF padrão de 8 bits para visualização conveniente do bouton de interesse.
Para realizar uma busca por boutons responsivos, você precisa de uma micropipette de vidro adequada para estimulação elétrica. Use um puxador de micropipette para produzir pipetas de estimulação de capilares de vidro borossilicato com diâmetros internos de ponta de cerca de um micrômetro. Para sondar a ação potencial liberação dependente de glutamato de um conjunto de boutons candidatos, selecione uma ampliação de 63x e um filtro de emissão de 510 nanômetros.
Carregue a imagem subtraída para permitir a colocação de um eletrodo de estimulação de vidro ao lado de uma varizes fluorescentes, evitando a proximidade de axônios adicionais. Em que varizes associadas a uma bifurcação máxima ou alocação dentro de parte mais profunda da fatia. Coloque o eletrodo de estimulação perto do ataque de interesse e desligue a luz, pois as gravações devem ser realizadas em completa escuridão.
Em seguida, ligue o sistema de aplicação de banho multicanal, com um canal fornecendo a solução padrão de banho e os outros canais fornecendo os bloqueadores necessários dos canais de íons, transportadores ou receptores de membrana, incluindo tetrototoxina para bloquear a geração potencial de ação. Controle o fluxo no local de gravação e ligue o estimulador para fornecer pulsos de corrente despolarizantes de duas a 10 microamps para a pipeta de estimulação. A liberação agora é ativada por fluxo direto de cálcio através de canais fechados de tensão.
Para visualizar a liberação de glutamato em desobstrução, usando o microscópio X, unidades Y, coloque o sensor de glutamato testado em forma de ataque positivo perto do centro de exibição. Depois de interromper a aquisição, clique na imagem com o botão esquerdo do mouse para determinar a posição X, Y do centro de ressarcia. As coordenadas X, Y do cursor de conjunto serão exibidas.
Usando os dados de calibração, calcule as coordenadas do local onde o raio laser deve ser enviado para a excitação da fluorescência do sensor de glutamato usando as fórmulas indicadas. Para criar uma sequência de um ponto no software de controle a laser, selecione o ponto na caixa de sequência na sequência do software de controle a laser e defina as corridas e o atraso de execução a zero, e a sequência para execução no TLL. Em seguida, clique na sequência de início.
No software de controle da câmera, selecione os parâmetros de imagem apropriados e selecione o início externo para o modo de gatilho. Clique em sinal de sinal no software de controle da câmera. Em seguida, inicie o protocolo experimental estabelecido para o dispositivo de gatilho, e implemente o teste experimental do protocolo com o cronograma apropriado, de modo que a câmera adquira 400 quadros com uma frequência de 2,48 kilohertz durante um teste, com uma frequência de repetição de 0,1 hertz ou menor.
Para identificar sinapses patológicas, ligue as rotinas de elevação e calcule a intensidade da fluorescência, média e desvio padrão para a região de interesse selecionada em repouso. Determine e encaixe a área ocupada por pixels com uma intensidade de fluorescência em repouso maior que a média mais três desvios padrão, e determine um diâmetro virtual em mícrons assumindo uma forma circular da área de limiar supra. Plote a intensidade da fluorescência contra o tempo, como a diferença entre o valor real da intensidade da fluorescência e o valor da intensidade da fluorescência em repouso dividido pelo valor de intensidade de fluorescência em repouso.
Determine o pico de amplitude da resposta à fluorescência. Realize um encaixe monoexponencial para a decadência do pico da resposta à fluorescência, e determine a constante de tempo de decomposição, TauD. Para estimar a amplitude máxima em uma dada sinapse, selecione o pixel com maior alteração na intensidade da fluorescência, que é o melhor indicador da carga de glutamato apresentada ao sistema de desembaraço da sinapse.
A imagem sinapse única pode ser usada para identificar duas classes de sinapses corticostriais usando os critérios de tamanho e proporção de pulso emparelhados. Em intervalos de estímulo de 20 a 50 milissegundos, os terminais interenteroquefólicos menores são propensos à depressão do pulso emparelhado, enquanto os terminais do trato piramimístico maior apresentaram facilitação de pulso emparelhada. Testes de comportamento motor realizados em camundongos e camundongos do tipo selvagem expressando um fenótipo de Huntington, revelam uma coorelação positiva significativa entre os resultados obtidos para o caminho total executado no campo aberto, e o passo sobre a latência.
Além disso, a imagem de glutamato de sinapse única mostra que os camundongos sintomáticos de Huntington apresentaram um déficit na velocidade da decadência do glutamato juxtassintáptico, como refletido nos valores taud das respostas do glutamato à estimulação de sinapse única. Em animais do tipo selvagem, tal prolongamento só foi observado após a aplicação de um inibidor seletivo e não transportável da absorção de glutamato. A avaliação da probabilidade de ocorrência de um dado valor taud em fatias de camundongos do tipo selvagem, e camundongos expressando os sintomas da doença de Huntington, revelou que em animais do tipo selvagem, TauD nunca excede 15 milissegundos.
No entanto, na doença sintomática de Huntington, 40% das sinapses apresentam valores taud entre 16 e 58 milissegundos, apesar da tendência de redução na quantidade de glutamato liberado. Portanto, TauD pode ser considerado como um biomarcador para sinapses disfuncionais na doença de Huntington, e pode ser usado ainda para verificar a recuperação funcional em experimentos direcionados ao transporte de glutamato astrócitico. Este protocolo para monitoramento de glutamato em sinapses corticostriatais individuais pode ajudar a esclarecer o papel da deficiência de absorção de glutamato na patogênese da doença neurodegenerativa.
A única imagem sinapse é particularmente útil para explorar locais pré-sinápticos de sinapses excitatórias.
