Терапия педагога стволовой клетки была разработана для лечения диабета I типа и других аутоиммунных заболеваний. Этот метод был разработан для изучения молекулы механизма, лежащего в основе иммунной умеренности стволовых клеток Педагог терапии через CB-SC выпустила экзосомы. Этот протокол обеспечивает руководство о том, как очистить экзосомы от человеческих культур стволовых клеток пуповинной крови и определить их иммунную модуляцию моноцитов.
Демонстрация процедуры будет Вэй Ху, аспирант, из моей лаборатории. Начнем с того, что центрифуга кондиционированной среды CB-SC в три раза больше, чем описано в текстовой рукописи, собирая супернатант в новую 50-миллилитровую коническую трубку после каждой центрифугации. После третьей центрифугации отфильтруй полученный супернатант с фильтром микролитра 0,22 и перенесите 15 миллилитров мультимедиа на каждый 10 килодальтонный центробежный фильтр.
Центрифуги при 4000 х г в течение 30 минут, чтобы изолировать концентрированные экзосомы. Перенесите концентрированные экзосомы в ультрацентрифугную трубку. Затем гранулы экзосомы при 100 000 х г в течение 80 минут при четырех градусах цельсия.
Затем отбросьте супернатант и повторно посовелите гранулированное экзосому в 10 миллилитров PBS. Выполните окончательный ультрацентрифугации для сбора экзом гранулы и повторно использовать его в 200 микролитров PBS. Добавьте 30 миллионов человеческих ПМВХ в 15-миллилитровую трубку и центрифугу при 300 х г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Повторное распределение клеток в 300 микролитров холодного PBS и добавить 60 микролитров CD14 микробусов. Хорошо перемешать и инкубировать клетки на льду в течение 15 минут. Добавьте еще шесть миллилитров холодного PBS и центрифуги при 300 x g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Затем повторно посовещенные клетки в 500 микролитров холодного буфера работает. Поместите разделительную колонку в магнитный сепаратор и помойте его три раза двумя миллилитров холодного бегущего буфера. Перенесите повторно натядные ячейки в столбец разделения и дайте им пройти.
Опять же, мыть столбец три раза с двумя миллилитров работает буфер на стирку. Затем поднимите столбец из магнитного сепаратора и поместите его на 15-миллилитровую центрифугу на льду. Elute CD14 положительные клетки с двумя миллилитров холодного буфера работает и центрифугированы на 300 х г в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию, чтобы гранулировать клетки.
Перезапределяйте гранулы в два миллилитров холодной химической определенной среды сыворотки и перенесите 50 микролитров ее в 1,5 миллилитровую трубку. Пятно полученных клеток с 10 микролитров Krome Orange-спряженных анти-человеческих CD14 моноклональных антител в течение 20 минут. Добавьте один миллилитр PBS и центрифугу при 300 x g в течение 10 минут, чтобы гранулировать клетки.
Перезаполнить клеточные гранулы в 200 микролитров PBS и передать его в пятими миллилитровую трубку. Определите чистоту CD14-моноцитов по цитометрии потока. Семя один миллион полученных очищенных моноцитов в культуре ткани лечение шести-хорошо пластины и инкубировать в течение двух часов при 37 градусов по Цельсию под 5%углекислого газа.
После инкубации отбросить супернатант и аккуратно добавить два миллилитров 37 градусов предварительно разогретой химической определяется сыворотки свободной культуры среды, а затем добавить 80 микрограммов CB-SC полученных экзосом в моноцитов культуры в шесть хорошо пластины с общим объемом двух миллилитров. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислого газа в течение трех-четырех дней. Затем изображение морфологии клеток с помощью перевернутого микроскопа при увеличении 200X.
Добавьте один миллилитр буфера диссоциации клеток на основе PBS, чтобы отделить клетки, трубя вверх и вниз, и собрать оставшиеся клетки с помощью клеточного скребка. Соберите клетки путем центрифугирования на 1, 690 х г в течение пяти минут и повторно использовать их в 200 микролитров PBS. Добавьте пять микролитров блокатора FC, чтобы заблокировать неспецифическую привязку, затем добавьте антитела.
Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 30 минут. Добавьте один миллилитр PBS в инкубированные клетки и центрифуга их на 300 х г в течение 10 минут. Повторное распределение гранул в 200 микролитров PBS и добавить пять микролитров пропидия йодида на образец.
Перенесите клетки в новую пятими миллилитровую трубку потока и выполните цитометрию потока для оценки уровней экспрессии CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 и CD209. Фенотип и чистота CB-SCs были изучены цитометрией потока с связанными с CB-SC маркерами. Анализ показал высокий уровень экспрессии CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 и галектина 9, но выражение CD34 не наблюдалось.
Анализ цитометрии потока также подтверждает экспрессию экзомических специфических маркеров, CD9, CD 81 и CD63 на экзосомах, полученных CB-SC. Размер морфологии экзосом характеризовался TEM и распределение размера было определено DLS. Западная помарка более далее доказывает выражение exome связанного маркера Alix без выражения маркера ER associated, calnexin.
Прямое взаимодействие Dio с маркировкой CB-SC-Exo с PBMC наблюдалось с помощью флуоресцентной микроскопии. Чтобы лучше определить, какая популяция клеток взаимодействовала с циферблатом с пометкой CB-SC-Exo, различные клеточные отсеки были закрыты с клеточными маркерами, такими как CD3 для Т-клеток, CD11C для миелоидных дендритных клеток, CD14 для моноцитов, CD19 для В-клеток и CD56 для НК-клеток. Моноциты были в первую очередь мишенью CB-SC полученных экзосом, поскольку они выставлены более высокие медианные интенсивности флуоресценции, чем у других иммунных клеток.
Экзосома обработанных моноцитов успешно дифференцированы в шпиндель-как морфологии. Было upregulation в уровне M2 связанных маркеров, such as CD163, CD206, и CD209 после обработки с CB-SC-производными exosomes. Фенотипическое сравнение обычных макрофагов М2 и экзомических макрофагов М2, вызванных CB-SC, не показало существенных различий.
Ключевым шагом в этом протоколе является добавление экзосом, полученных CB-SC, в моноциты культуры в шести-хорошо пластины и инкубировать его в течение трех-четырех дней, которые необходимы для дифференциации клетки к другому типу 2 макрофагов с шпиндель-как морфология. Далее, мы собираемся изучить молекулы компонентов внутри CB-SC полученных экзосом, которые способствовали индукции дифференциации моноцитов в тип 2 макрофагов.
