Этот протокол имеет важное значение для создания и определения разума и тела желаемых мутаций в геноме Pseudomonas aeruginosa, а также для тестирования влияния мутаций на снижение вирулентности в воспроизводимой модели мыши. Ключевым преимуществом этого метода является хром проверки и воспроизводимость мышиной модели инфекции. Бактерии постоянно работают, постоянно меняются.
Чтобы замедлить этот процесс, мы используем замороженные остановки, мешок их, повесить их на несколько ступеней на модификации перед тестированием их в модели мыши. Кто-то, кто не знаком с этими методами, скорее всего, будет бороться с разработкой и выбором возможного рекомбинанта кроссовера для тестирования. Кроме того, обработка мышей для инфекции будет трудно для тех, кто не знаком с работой животных.
Этот метод может быть применен для тестирования других патогенов и их мутантов, а также вирулентности заразить мышей. По сравнению с текущими моделями, процедуры с воспроизводимостью плюс проверка клонов до и после заражения могут принести пользу другим следователям в этой области. Визуальная демонстрация этого протокола дает представление о обширных процедурах, которые может быть трудно понять или понять, читая в одиночку.
Начните с выращивания одного кроссовера, рекомбинантных колоний в Pseudomonas Isolation Broth, или PIB. Прививка и полоса 10 микролитров каждой культуры на предварительно разогретые пластины PIA, дополненные 10% сахарозой. Затем инкубировать пластины на ночь при 37 градусов по Цельсию.
На следующий день снимите пластины с инкубатора и осмотрите их на рост. Колония, устойчивая к сахарозе, должна быть двойным кроссовером рекомбинантов. Используйте стерильные зубочистки, чтобы залатать по крайней мере 20 колоний на предварительно разогретых пластин PIA, PIA дополнен 10% сахарозы, и PIA дополнен карбенициллин.
Инкубировать пластины на ночь и изучить их на рост на следующий день. Настоящие двойные рекомбинанты кроссовера будут карбенициллин-чувствительными и сахарозными. Экран от 10 до 20 колоний для удаления, с использованием колонии ПЦР.
Подберите рост предполагаемого двойного кроссовера рекомбинантным со стерильной зубочисткой и приостановите его в 50 микролитров PBS. Отварить суспензию при 100 градусах по Цельсию в течение 10 минут. Центрифуга в течение трех минут при 13 000 раз G и поместите его на лед.
Затем выполните ПЦР в соответствии с рукописными указаниями. Как только ПЦР закончен, выполните электрофорез агарозного геля на продуктах. Меньшие продукты усиления указывают на колонии, в которых регион, представляющий интерес, был удален.
Утром инъекций, оттепель криовиалы бактериальных клеток при четырех градусах по Цельсию в течение трех-четырех часов. Держите флаконы на льду после оттаивания и вводить мышей в течение двух часов. Перенесите содержимое каждого криовиалового в новую двухмилитровую трубку и центрифуга в 4500 раз G в течение 10 минут.
Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы клетки в один миллилитр PBS. Повторите центрифугирование и повторно приостанавливайте клетки в PBS до конечной концентрации в 2,5 раза от 10 до девятой колонии, образуя единицы на миллилитр. Возьмите три образца из окончательной суспензии каждого штамма для проверки концентрации, генотипа и фенотипа.
Для каждого штамма, aliquot 1,5 миллилитров клеточной подвески в две миллилитровые трубки и подготовить PBS для контроля инъекций. Соберите мышей и материалы, необходимые для инъекций в стерильной комнате хирургии животных и протрите все поверхности с дезинфицирующими салфетками до начала. Носите две пары латексных перчаток, чтобы ограничить риск прокола, если укусил, а также лабораторное пальто, защитные очки и маску для лица.
Удалите мышь из клетки и взвесить ее, отмечая хвост постоянным маркером для отслеживания после инъекций. Откройте новый одноми миллилитровый шприц с иглой 27 калибра и нарисуйте 200 микролитров стерильных PBS. Захватите мышь за уши, используя большой палец и указательный палец, и щепотку, чтобы создать складку кожи на затылке.
Затем закрените хвост в ладонь, используя мизинец, чтобы держать мышь плоской и неподвижной. Вставьте иглу под углом 30 градусов в брюшную полость слева или справа от средней линии. Слегка поднимите иглу, чтобы убедиться, что она не была вставлена в органы.
Затем медленно ввиснуть PBS и снять иглу. Болус в месте инъекции является типичным. Поместите иглу в назначенный контейнер для удаления остроты и переместите мышь в отдельную клетку.
Повторите процедуру со следующей мышью и в конце концов мышей из одной клетки вводят, переместить их обратно в свою первоначальную клетку. После введения контрольной группы ввимите тестовые группы с использованием той же процедуры. Как только все инъекции будут завершены, верните мышей в жилищную комнату и очистите рабочую зону с помощью дезинфицирующих салфеток.
Для изображения животных подготовьтесь к системе визуализации, установив параметры камеры и нагревая сцену. Установите поток кислорода до 1,5 литра в минуту и изофлюран до 3,5% и переместите мышь в анестезиа, затем в стадию стабилизации температуры, после анестезии. Распоимите мышь на спине с вытянутыми руками и подготовьте носовой конус для администрирования 2,5%изофлюрана во время визуализации.
Закройте дверь и сделайте биолюминесцентные изображения и рентгеновские снимки мыши. Когда изображение будет завершено, верните мышь в клетку и следите за ней. Он должен восстановить сознание в течение трех-пяти минут.
Целевые геномные удаления были подтверждены колонией ПЦР с конкретными грунтовки, которые усилили область интереса. Колонии с геномное удаление дают более короткую полосу ПЦР по сравнению с колониями дикого типа. Внутриперитонеальная инъекция атенуированного штамма P aeruginosa, PGN 5, привела к 0%-ной смертности, эквивалентной смертности, наблюдаемой с E.coli BL 21.
Инъекция родительского штамма, однако, была смертельной для 80% мышей. Прогрессирование инфекции отслеживалось с помощью биолюминесценции, отмеченной родительскими и затуханием штаммов. Затухающий штамм оставался локализованным в месте инъекции до тех пор, пока биолюминесценция не исчезла, что, вероятно, совпало с очисткой инфекции.
Представленный метод только исследовал смертность, производимую штаммом. Более глубокие иммунологические и токсикологические аспекты могут быть использованы для определения динамики инфекции и конечного эффекта инфекции, который не приводит к смерти. Самое главное в процедуре является обширная проверка сделано, между различными шагами от первоначальной идентификации на животных тестирования.
Отсутствующие определенные шаги проверки потенциально могут привести к неправильному результату, так как проверенные штаммы могут пройти мутацию и отбор, или стать загрязненными. С развитием этих двух методов, мы думаем, что это позволит нашим исследователям в области инфекционной иммунологии более эффективно исследовать, как мощное взаимодействие пакетов приводит к экстремальному фенотипу, сепсису и смертности. Различные питательные'impact на варианты можно сравнить через размер досирования бактерий.
