פרוטוקול זה הוא משמעותי עבור יצירה וקביעה של מוטציות הרצויות גוף-הנפש בגנום של Pseudomonas aeruginosa, כמו גם בדיקת ההשפעה של מוטציות על הפחתת ארסיות במודל עכבר להתרבות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא אימות כרום ושחזור של מודל זיהום עכבר. חיידקים עובדים כל הזמן, משתנים ללא הרף.
כדי להאט את התהליך הזה, אנו משתמשים עצירות קפואות, שקית אותם, לתלות אותם על שלבים מרובים על שינוי לפני בדיקת אותם במודל העכבר. מישהו לא מכיר את השיטות האלה יהיה ככל הנראה נאבק עם הפיתוח והבחירה של רקומביננטי מוצלב אפשרי לבדיקה. יתר על כן, הטיפול בעכברים לזיהום יהיה קשה עבור מישהו לא מוכר עם עבודה בבעלי חיים.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת על בדיקת פתוגנים אחרים המוטנטים שלהם, כמו גם ארסיות להדביק בעכברים. בהשוואה למודלים הנוכחיים, הליכים עם רבייה בתוספת אימות שיבוט לפני ואחרי ההדבקה יכולים להועיל לחוקרים אחרים בתחום. הדגמה חזותית של פרוטוקול זה מספקת תובנה להליכים נרחבים שעשויים להיות קשים להבנה או להבנה באמצעות קריאה בלבד.
התחל על ידי גידול מוצלב יחיד, מושבות רקומביננטיות במרק בידוד Pseudomonas, או PIB. חסן ופס 10 microliters של כל תרבות על צלחות PIA מחומם מראש, בתוספת 10% סוכרוז. ואז לה הדגירה את הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
למחרת, להסיר את הצלחות מן החממה ולבדוק אותם לצמיחה. המושבה העמידה בפני סוכרוז צריכה להיות רקומביננטי קרוסאובר כפול. השתמשו בקיסמים סטריליים כדי לטלאים לפחות 20 מושבות על צלחות מחוממות מראש של PIA, PIA בתוספת 10% סוכרוז ו-PIA בתוספת קרבניצילין.
דגירה הצלחות לילה ולבחון אותם לצמיחה ביום שלמחר. רקומביננטים כפולים אמיתיים יהיו רגישים לקרבצילין ועמידים בפני סוכרוז. מסך 10 עד 20 מושבות למחיקה, באמצעות PCR המושבה.
להרים את הצמיחה של רקומביננטי מוצלב כפול חשוד עם קיסם סטרילי ולהשעות אותו ב 50 microliters של PBS. מרתיחים את ההשעיה ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. צנטריפוגה זה במשך שלוש דקות ב 13, 000 פעמים G ולה מניח אותו על קרח.
לאחר מכן, בצע PCR על פי הוראות כתב היד. לאחר PCR הוא סיים, לבצע אלקטרופורזה ג'ל אגרוז על המוצרים. מוצרי הגברה קטנים יותר מצביעים על מושבות שבהן אזור העניין נמחק.
בבוקר של זריקות, להפשיר את cryovials של תאים חיידקיים בארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש עד ארבע שעות. שמור את הבקבוקונים על קרח לאחר הפשרה ולהזריק את העכברים בתוך שעתיים. מעבירים את התוכן של כל cryovial לצינור חדש שני מיליליטר צנטריפוגה אותו ב 4, 500 פעמים G במשך 10 דקות.
השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של PBS. חזור על הצנטריפוגה והשהה מחדש את התאים ב- PBS לריכוז סופי של 2.5 פעמים 10 למושבה התשיעית ויוצרים יחידות למיליליטר. קח שלוש דגימות מן ההשעיה הסופית של כל זן כדי לאמת ריכוז, גנוטיפ, פנוטיפ.
עבור כל זן, aliquot 1.5 מיליליטר של ההשעיה התא לתוך צינור שני מיליליטר ולהכין את PBS עבור זריקות בקרה. אסוף את העכברים ואת החומרים הדרושים לזריקות בחדר ניתוחי של בעלי חיים סטריליים ונגב את כל המשטחים עם מגבונים לחיטוי לפני תחילת. ללבוש שני זוגות של כפפות לטקס כדי להגביל את הסיכון של לנקב, אם ננשך, כמו גם חלוק מעבדה, משקפי בטיחות, ומסכת פנים.
הסר את העכבר מהכלוב ולשקול אותו, סימון הזנב עם סמן קבוע למעקב לאחר הזרקה. פתח מזרק מיליליטר חדש עם מחט מד 27 ולצייר 200 microliters של PBS סטרילי. תפוס את העכבר מאחורי אוזניו, באמצעות האגודל והאוהל, וצבוט כדי ליצור קפל עור בעורף הצוואר.
לאחר מכן, לאבטח את הזנב לתוך כף היד באמצעות הזרת להחזיק את העכבר שטוח ללא תנועה. הכנס את המחט בזווית של 30 מעלות לחלל ההנצחה משמאל או מימין לקו האמצע. הרם מעט את המחט כדי לוודא שהיא לא הוכנסה לאיברים.
לאחר מכן, לאט להזריק את PBS ולמשוך את המחט. בולוס באתר ההזרקה הוא אופייני. מניחים את המחט במיכל סילוק החדים המיועד ומעבירים את העכבר לכלוב נפרד.
חזור על ההליך עם העכבר הבא ואחרי כל העכברים מכלוב אחד מוזרקים, להעביר אותם בחזרה לכלוב המקורי שלהם. לאחר הזרקת קבוצת הביקורת, הזרק את קבוצות הבדיקה באמצעות אותו הליך. לאחר השלמת כל הזריקות, להחזיר את העכברים לחדר הדיור ולנקות את אזור העבודה עם מגבונים חיטוי.
כדי לצלם את בעלי החיים, הכינו את מערכת ההדמיה על ידי קביעת פרמטרי המצלמה וחימום הבמה. הגדר את זרימת החמצן ל 1.5 ליטר לדקה ו isoflurane ל 3.5% ולהזיז את העכבר לתא ההרדמה, ולאחר מכן לשלב התייצב הטמפרטורה, לאחר הרדמה. מקם את העכבר על גבו עם זרועות מושטות והתאים חרוט האף לניהול של 2.5% isoflurane במהלך הדמיה.
סגור את הדלת ולצלם תמונות bioluminescent וצילומי רנטגן של העכבר. לאחר השלמת ההדמיה, החזר את העכבר לכלוב שלו ונטר אותו. היא אמורה לחזור להכרה תוך שלוש עד חמש דקות.
המחיקות הגנומיות הממוקדות אושרו על ידי PCR המושבה עם פריימרים ספציפיים שהגבירו את אזור העניין. מושבות עם המחיקה הגנומית מניבות רצועת PCR קצרה יותר בהשוואה למושבות מסוג פראי. הזרקה תוך-לידתית של הזן המותר של P aeruginosa, PGN חמש, הביאה לתמותה של 0%, שווה ערך לתמותה שנצפתה עם E.coli BL 21.
הזרקת זן ההורה, לעומת זאת, הייתה קטלנית ל-80% מהעכברים. התקדמות הזיהום היה במעקב באמצעות הורה מסומן bioluminescence וזנים יומתו. הזן שהוחלץ נשאר מקומי באתר ההזרקה עד הביולומינציה דהוי, אשר ככל הנראה בד בבד עם אישור של זיהום.
השיטה שהוצגה בחנה רק את התמותה המיוצרת על ידי הזן. היבטים אימונולוגיים וטוקסיקולוגיים מעמיקים יותר יכולים להיות מנוצלים כדי לקבוע את הדינמיקה של זיהום ואת ההשפעה הסופית שיש לזיהום שאינה גורמת למוות. הדבר החשוב ביותר בהליך הוא האימות הנרחב שנעשה, בין שלבים שונים מזיהוי ראשוני לניסויים בבעלי חיים.
החמצת שלבי אימות מסוימים עלולה להוביל לתוצאה שגויה, כיוון שהזנים שנבדקו עלולים לעבור מוטציה ובחירה, או להיות מזוהמים. עם התפתחותן של שתי טכניקות אלה, אנו חושבים שזה יאפשר לחוקרים שלנו בתחום אימונולוגיה של זיהומים לחקור בצורה יעילה יותר כיצד אינטראקציית חבילה חזקה מובילה לפנוטיפ קיצוני, אלח דם ותמותה. ניתן להשוות בין חומרים מזינים שונים לגרסאות באמצעות מנון גודל של חיידקים.
