このプロトコルは、緑膿菌のゲノムに望ましい心体の変異を作成および決定し、また、再現可能なマウスモデルにおける病原性低下に対する突然変異の効果を試験する上で重要である。この手法の主な利点は、クロムの検証とマウス感染モデルの再現性です。細菌は絶えず働き続け、絶えず変化しています。
このプロセスを遅くするには、フリーズされたストップを使用し、それらを袋に入れ、マウスモデルでテストする前に、変更時に複数のラングに掛けます。これらの方法に精通していない人は、おそらくテストするために可能なクロスオーバー組換えの開発と選択に苦労するでしょう。さらに、動物の仕事に慣れていない人にとっては、感染のためのマウスの取り扱いが難しくなります。
この方法は、他の病原体とその変異体の検査に適用できるだけでなく、マウスの毒性感染も可能である。現在のモデルと比較して、再現性と感染前後のクローン検証を伴う手順は、現場の他の研究者に利益をもたらす可能性があります。このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは、読み取りだけでは理解または理解することが困難な広範な手順に関する洞察を提供します。
シュードモナスアイソレーションブロス、またはPIBで単一のクロスオーバー、組換えコロニーを成長させることから始めます。各培養物の10マイクロリットルを事前に温めたPIAプレートに接種し、10%スクロースを加える。その後、37°Cで一晩プレートをインキュベートします。
翌日、インキュベーターからプレートを取り出し、成長検査を行います。スクロース耐性コロニーは、二重交差組換えであるべきである。滅菌爪楊枝を使用して、PIAの事前に温めたプレートに少なくとも20個のコロニーをパッチし、PIAに10%スクロースを加え、PIAにカルベニシリンを加えます。
プレートを一晩インキュベートし、翌日に成長を調べます。真の二重交差組換えは、カルベニシリン感受性およびスクロース耐性である。10〜20コロニーを削除する、コロニーPCRを用いた。
無菌爪楊枝を持つ疑わしい二重クロスオーバー組換え剤の成長を拾い、PBSの50マイクロリットルでそれを中断します。100°Cで10分間沸騰させます。Gの13,000倍で3分間遠心分離し、氷の上に置きます。
次に、原稿の指示に従ってPCRを行う。PCRが終了したら、製品に対してアガロースゲル電気泳動を行います。より小さい増幅産物は、対象領域が削除されたコロニーを示す。
注射の朝、細菌細胞の凍結を摂氏4度で3~4時間解凍する。解凍後にバイアルを氷の上に置き、2時間以内にマウスを注入します。各凍結の内容物を新しい2ミリリットルチューブに移し、それを4,500回Gで10分間遠心分離します。
上清を捨て、PBSの1ミリリットルで細胞ペレットを再中断します。遠心分離を繰り返し、PBS中の細胞を1ミリリットル当たり9番目のコロニー形成単位に2.5倍の最終濃度に再中断する。各菌株の最終懸濁液から3つのサンプルを採取し、濃度、遺伝子型、表現型を検証します。
各株について、2ミリリットルチューブに細胞懸濁液のアリコート1.5ミリリットルを、コントロール注射のためにPBSを準備します。無菌動物外科室で注射に必要なマウスと材料を収集し、開始する前に消毒ワイプですべての表面を拭きます。ラテックス手袋を2足着用して、刺された場合のパンクのリスクを制限し、ラボコート、安全メガネ、フェイスマスクを着用してください。
ケージからマウスを取り出し、重量を量り、注射後の追跡のために永久的なマーカーで尾をマークします。27ゲージ針で新しい1ミリリットルの注射器を開き、200マイクロリットルの無菌PBSを引き出します。親指と人差し指を使って耳の後ろにマウスをつかみ、首のうなじで皮膚の折り目を作成するためにピンチ。
その後、ピンキーを使用して尾を手のひらに固定し、マウスを平らにして不動の状態にします。正中線の左右の腹腔に30度の角度で針を挿入します。わずかに、それが臓器に挿入されていないことを確認するために針を持ち上げます。
その後、ゆっくりとPBSを注入し、針を引き出します。注射部位のボーラスは典型的です.針を指定されたシャープ処理容器に入れ、マウスを別のケージに移動します。
次のマウスで手順を繰り返し、1つのケージからのすべてのマウスを注入した後、元のケージに戻します。コントロールグループを注入した後、同じ手順を使用してテストグループを注入します。すべての注射が完了したら、マウスをハウジングルームに戻し、消毒ワイプで作業領域をきれいにします。
動物を画像化するには、カメラパラメータを設定し、ステージを加熱して撮像システムを準備します。酸素の流れを1分あたり1.5リットル、イオブルランを3.5%に設定し、マウスを麻酔室に移動し、麻酔に続いて温度安定化ステージに移動します。マウスを腕を伸ばして背中に置き、イメージング中に2.5%isofluraneを投与するために鼻コーンをフィットさせます。
ドアを閉め、マウスの生物発光画像とX線を撮ります。イメージングが完了したら、マウスをケージに戻して監視します。それは3〜5分以内に意識を取り戻す必要があります。
標的ゲノム欠失は、対象領域を増幅する特異的プライマーを有するコロニーPCRによって確認された。ゲノム欠失を有するコロニーは、野生型コロニーに比べて短いPCRバンドを生み出す。P緑素吸皮症の減衰株の腹腔内注射は、PGN5、0%の死亡率をもたらし、大腸菌BL21で観察された死亡率と同等である。
しかし、親株の注射は、マウスの80%に致命的であった。感染の進行は、生物発光印の親および減衰株を用いて追跡された。減弱株は、生物発光が薄れるまで注射部位に局在したままでした, 感染のクリアランスと一致する可能性が高いです.
提示された方法は、株によって生成された死亡率のみを調べた。より深い免疫学的および毒物学的側面は、感染のダイナミクスと感染が死に至らない最終的な影響を決定するために利用することができる。手順で最も重要なことは、最初の識別から動物実験までの様々なステップの間に行われる広範な検証です。
特定の検証ステップを見逃すと、テストされた株が突然変異や選択を受けたり、汚染されたりする可能性があるため、間違った結果につながる可能性があります。これら2つの技術の開発により、感染免疫学の分野の研究者は、強力なパッケージ相互作用が極端な表現型、敗血症、死亡率につながる方法をより効果的に調査できるようになると考えています。異なる栄養素の変異体への影響は、細菌のサイズのドージングを介して比較することができます。.
