在伪单体中生成帧内基因删除突变体，并在简单小鼠感染模型中测试病毒衰减

该协议对于在伪多莫纳斯亚鲁吉诺萨的基因组中创建和确定心身所需的突变，以及测试突变对可重复小鼠模型中毒性降低的影响，具有十分重大意义。此技术的主要优点是铬验证和小鼠感染模型的可重复性。细菌在不断工作，不断变化。

为了减慢此过程，我们使用冻结停止，袋他们，挂在多个运行修改，然后再测试他们在鼠标模型中。不熟悉这些方法的人很可能会与开发和选择可能的交叉重组测试斗争。此外，对于不熟悉动物工作的人来说，处理小鼠感染将是困难的。

该方法可用于检测其他病原体及其突变体，以及小鼠的毒性感染。与目前的模型相比，具有可重复性的程序以及感染前和感染后克隆验证程序可使该领域的其他研究人员受益。此协议的可视化演示提供了对可能难以理解或仅通过阅读理解的广泛程序的见解。

首先在伪单体隔离肉汤中生长单交叉、重组菌落或 PIB。将每种培养的 10 微升接种并条纹到预热的 PIA 板上，并辅以 10% 蔗糖。然后在37摄氏度下孵育板。

第二天，从培养箱中取出盘子，检查它们的生长。耐蔗糖的菌落应该是双交叉重组剂。使用无菌牙签将至少 20 个菌落修补到 PIA 预热板上，PIA 辅以 10% 蔗糖，PIA 补充卡贝尼西林。

孵育板过夜，并在第二天检查其生长。真正的双交叉重组剂对卡贝尼西林敏感，耐蔗糖。屏幕 10 到 20 个殖民地删除，使用殖民地 PCR。

拿起一个疑似双交叉重组与无菌牙签的生长，并暂停它在50微升PBS。将悬浮液在100摄氏度下煮10分钟。在13，000次G下离心3分钟，然后放在冰上。

然后，根据手稿指示执行 PCR。PCR 完成后，对产品执行阿加糖凝胶电泳。较小的放大产品表示已删除感兴趣区域的菌落。

注射的早晨，在摄氏四度下解冻细菌细胞的低温，解冻三到四个小时。解冻后将小瓶放在冰上，并在两个小时内给老鼠注射。将每个冷冻的内热物转移到一个新的两毫升管中，并在4，500次G下离心10分钟。

丢弃上一提液，将细胞颗粒重新悬浮在PBS的一毫升中。重复离心，将PBS中的细胞重新悬浮到每毫升形成单位的第九组，最终浓度为2.5倍10。从每种菌株的最终悬浮物中抽取三个样本，以验证浓度、基因型和表型。

对于每种菌株，将1.5毫升的细胞悬浮液放入两毫升管中，并准备用于控制注射的PBS。将无菌动物手术室注射所需的小鼠和材料收集起来，并在开始前用消毒湿巾擦拭所有表面。戴上两副乳胶手套，以限制被刺的风险（如果被咬伤）以及实验室外套、安全眼镜和面罩。

将鼠标从保持架上取下并称重，用永久标记标记尾部，用于注射后跟踪。用27针打开一个新的毫升注射器，并绘制200微升无菌PBS。用拇指和食指抓住耳朵后面的鼠标，捏捏，在颈部的尿布处形成皮肤褶皱。

然后，用粉红色将尾巴固定到手掌中，使鼠标保持不动。以 30 度角将针头插入中线左侧或右侧的腹腔中。稍微抬起针头，确保针头不会插入器官。

然后，慢慢注射PBS并取针。注射部位的螺栓是典型的。将针头放在指定的锐器处理容器中，然后将鼠标移到单独的保持架中。

用下一只鼠标重复这个程序，注射一个笼子的所有小鼠后，将它们移回原来的笼子。注入对照组后，使用相同的过程注入测试组。完成所有注射后，将小鼠返回到住房室，然后用消毒湿巾清洁工作区。

要对动物进行成像，请通过设置摄像机参数和加热舞台来准备成像系统。将氧气流量设置为每分钟 1.5 升，将异氟兰为 3.5%，然后将鼠标移到麻醉室，然后在麻醉后将鼠标移到温度稳定阶段。将鼠标放在其背部，伸出手臂，在成像过程中安装鼻锥，以管理 2.5%等值。

关上门，拍摄小鼠的生物发光图像和X光。成像完成后，将鼠标返回到其保持架并监视它。它应该在三到五分钟内恢复知觉。

目标基因组删除由殖民地PCR确认与特定的底因，放大了感兴趣的区域。与野生菌落相比，具有基因组缺失的菌落产生较短的PCR带。PGN 5的P aeruginosa的衰减菌株的内向注射导致0%的死亡率，相当于用大肠杆菌BL 21观察到的死亡率。

然而，注射父应变对80%的小鼠是致命的。使用生物发光标记的父系和衰减菌株跟踪感染进展。衰减菌株在注射部位保持局部，直到生物发光褪色，这很可能与清除感染相吻合。

该方法只检查了菌株产生的死亡率。更深入的免疫学和毒理学方面可用于确定感染的动态和感染的最终结果，不会导致死亡。过程中最重要的事情是进行广泛的验证，从初始鉴定到动物测试的各个步骤之间。

缺少某些验证步骤可能会导致错误的结果，因为测试的菌株可能会发生突变和选择，或受到污染。随着这两种技术的发展，我们认为这将使我们的感染免疫学领域的研究人员更有效地研究强大的包相互作用如何导致极端的表型、败血症和死亡率。可以通过细菌的量分来比较不同营养素对变异的影响。