이 프로토콜은 슈도모나스 아에루기노사의 게놈에서 마음-몸 원하는 돌연변이를 만들고 결정하는 데 중요하며, 재현 가능한 마우스 모델의 독성 감소에 대한 돌연변이의 효과를 테스트하는 데 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 크롬 유효성 검사 및 마우스 감염 모델의 재현성입니다. 박테리아는 지속적으로 작동, 지속적으로 변화.
이 과정을 늦추기 위해, 우리는 냉동 정지를 사용, 가방, 마우스 모델에서 그들을 테스트하기 전에 수정에 여러 렁에 걸. 이러한 방법에 익숙하지 않은 사람은 테스트 할 수있는 크로스 오버 재조합의 개발 및 선택에 가장 가능성이 어려움을 겪을 것입니다. 더욱이, 감염을 위한 마우스의 취급은 동물 작용에 익숙하지 않은 누군가를 위해 어려울 것입니다.
이 방법은 그밖 병원체 및 그들의 돌연변이를 시험하기 위하여 적용될 수 있고, 뿐만 아니라 독성은 마우스에 있는 감염합니다. 현재 모델에 비해, 감염 전후 의 재현성 플러스 클론 검증을 가진 절차는 필드에 있는 그밖 조사자에게 유익할 수 있습니다. 이 프로토콜의 시각적 데모는 읽기만으로 이해하기 어렵거나 이해하기 어려울 수 있는 광범위한 절차에 대한 통찰력을 제공합니다.
슈도모나스 격리 국물 또는 PIB에서 단일 크로스 오버, 재조합 식민지를 성장하여 시작합니다. 10%의 자당으로 보충된 사전 데운 PIA 플레이트에 각 배양의 10 마이크로리터를 접종하고 줄무늬로 합니다. 그런 다음 하룻밤 동안 접시를 섭씨 37도에서 배양합니다.
다음 날, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 성장을 검사합니다. 자당 저항 하는 식민지 이중 크로스 오버 재조합 이어야 한다. 멸균 이쑤시개를 사용하여 최소 20개의 콜로니를 PIA의 미리 데운 접시에 패치하고, PIA는 10%의 자당으로 보충되고, CARbenicillin으로 보충된 PIA를 사용합니다.
하룻밤 동안 접시를 배양하고 다음 날 성장을 위해 그들을 검사합니다. 진정한 이중 크로스오버 재조합은 카베니실린에 민감하고 자당에 강합니다. 콜로니 PCR을 사용하여 삭제를 위해 10~20개의 콜로니를 화면으로 검사합니다.
멸균 이쑤시개를 가진 의심되는 이중 크로스 오버 재조합의 성장을 선택하고 PBS의 50 마이크로 리터에서 그것을 중단하십시오. 서스펜션을 섭씨 100도에서 10분간 끓입니다. 원심 분리기는 13, 000배 G에서 3분간 얼음 위에 놓습니다.
그런 다음 원고 방향에 따라 PCR을 수행합니다. PCR이 완료되면 제품에 아가로즈 젤 전기 전도를 수행하십시오. 더 작은 증폭 제품은 관심 영역이 삭제된 식민지를 나타냅니다.
주사의 아침에, 3 ~ 4 시간 동안 섭씨 4도에서 세균 세포의 극저온을 해동. 해동 후 얼음에 바이알을 유지하고 2 시간 이내에 마우스를 주입하십시오. 각 극저온의 내용을 새로운 2밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리기는 4, 500회 G에서 10분 동안 전달합니다.
상체를 버리고 PBS의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 원심분리를 반복하고 PBS에서 세포를 밀리리터당 9번째 콜로니 형성 단위로 2.5배 10배의 최종 농도로 다시 중단한다. 각 균주의 최종 현탁액에서 3개의 샘플을 채취하여 농도, 유전자형 및 표현형을 검증합니다.
각 균주에 대해, 2 밀리리터 튜브로 세포 현탁액의 알리쿼트 1.5 밀리리터를 대조주사용 PBS를 준비한다. 멸균 동물 외과실에서 주사에 필요한 마우스와 재료를 수집하고 시작하기 전에 물티슈로 모든 표면을 닦아냅니다. 라텍스 장갑 2켤레를 착용하여 물린 경우 펑크의 위험을 제한하고 실험실 코트, 안전 안경 및 얼굴 마스크를 착용하십시오.
케이지에서 마우스를 제거하고 무게를 측정하여 주사 후 추적을 위한 영구 마커로 꼬리를 표시합니다. 27 게이지 바늘로 새로운 1 밀리리터 주사기를 열고 멸균 PBS200 마이크로리터를 그립니다. 마우스를 귀 뒤에 잡고 엄지와 집게 손가락을 사용하여 꼬집어 목의 목덜미에 피부 주름을 만듭니다.
그런 다음, 마우스를 평평하게 잡고 움직이지 않는 핑키를 사용하여 손바닥에 꼬리를 고정하십시오. 바늘을 30도 각도로 중간라인의 왼쪽 또는 오른쪽으로 복막 구멍에 삽입합니다. 바늘을 약간 들어 올려 장기에 삽입되지 않았는지 확인합니다.
그런 다음, 천천히 PBS를 주입하고 바늘을 철회. 주사 부위의 볼루스는 일반적입니다. 지정된 날카로운 폐기 용기에 바늘을 놓고 마우스를 별도의 케이지로 옮습니다.
다음 마우스로 절차를 반복하고 한 케이지의 모든 마우스가 주입 된 후 원래 케이지로 다시 이동합니다. 대조군을 주입한 후 동일한 절차를 사용하여 테스트 그룹을 주입합니다. 모든 주사가 완료되면 마우스를 하우징 룸으로 돌려보내 위생 물티슈로 작업 영역을 청소하십시오.
동물을 이미지화하려면 카메라 매개 변수를 설정하고 스테이지를 가열하여 이미징 시스템을 준비합니다. 산소 흐름을 분당 1.5리터로 설정하고 이소플루란을 3.5%로 설정하고 마우스를 마취실로 옮은 다음 마취 후 온도 안정화 단계로 이동합니다. 팔을 뻗은 마우스를 등에 놓고 이미징 중에 2.5 %의 이소플루란을 투여하기 위해 코 콘에 맞습니다.
문을 닫고 마우스의 생체 발광 이미지와 엑스레이를 찍습니다. 이미징이 완료되면 마우스를 케이지로 반환하고 모니터링합니다. 그것은 3 ~ 5 분 이내에 의식을 회복해야합니다.
표적 게놈 삭제는 관심 있는 지역을 증폭시킨 특정 프라이머를 가진 식민지 PCR에 의해 확인되었습니다. 유전체 삭제를 가진 식민지는 야생 형 식민지에 비해 짧은 PCR 밴드를 산출한다. P aeruginosa, PGN 5의 감쇠 된 균주의 인과 간 주사는 대장균 BL 21로 관찰 된 사망률과 동등한 0 %의 사망률을 초래했습니다.
그러나 부모 균주의 주입은 마우스의 80%에 치명적이었습니다. 감염 진행은 생물 발광 표시 부모와 감쇠된 긴장을 사용하여 추적되었습니다. 감쇠된 긴장은 생물 발광이 희미해질 때까지 주사 부위에 국한된 남아 있었습니다, 이는 가능성이 감염의 간격과 일치합니다.
제시된 방법은 균주에 의해 생성된 사망률을 검사했습니다. 보다 심층적인 면역학적 및 독성적 측면은 감염의 역학과 감염이 사망을 초래하지 않는 최종 효과를 결정하기 위해 활용될 수 있다. 절차에서 가장 중요한 것은 초기 식별에서 동물 실험에 이르기까지 다양한 단계 간에 광범위한 검증이 수행된다는 것입니다.
시험된 균주가 돌연변이 및 선택을 겪거나 오염될 수 있기 때문에 특정 유효성 검사 단계를 놓치면 잠재적으로 잘못된 결과로 이어질 수 있습니다. 이 두 기술의 발달로, 우리는 이것이 감염 면역학의 필드에 있는 우리의 연구원이 극단적인 표현형, 패혈증 및 사망에 어떻게 강력한 포장 상호 작용이 이끌어 내는지 보다 효과적으로 조사하는 것을 허용할 것이라고 생각합니다. 변이체에 대한 다른 영양소의 영향은 박테리아의 크기 주체를 통해 비교할 수 있습니다.
