Нейроденеграция при многих неврологических расстройствах является хроническим процессом, потеря нейронного волокна которого часто происходит до потери тела клетки. Стереологическая количественная оценка нейронных волокон в трех измерениях обеспечивает чувствительный и точный метод для обнаружения ранних нейродегенеративных изменений. Эта технология использует надежную и эффективную компьютерную объективную фракционирование космических шаров для измерения длины линейных структур, таких как нейронные волокна в 3D.
Демонстрация процедуры будет сделано Прабхакар Сингх, пост-док и наш эксперт в области стереологии, и Дэвид Пэн, научный сотрудник в моей лаборатории. После подтверждения отсутствия реакции на педаль рефлекс в анестезии мыши, транскардиально perfuse с примерно 50 миллилитров ледяной 0,1 молярного DPBS, а затем примерно 25 миллилитров 4%PFA в 0,1 молар PBS. В конце перфузии, после фиксации мозга в контейнере свежих 4%PFA в течение 24 часов при четырех градусах по Цельсию.
На следующий день, мыть мозг с тремя от одной до двух минут моет в свежем DPBS за мытье и передачи мозга в 15% сахарозы в 0,1 DPBS раствор на ночь. На следующее утро поместите мозг в 30% раствор сахарозы и 0,1 молярного DPBS в течение 48 часов при четырех градусах по Цельсию. В конце инкубации перенесите мозг в криотомерную камеру, предварительно установленную до минус 20 градусов по Цельсию.
Мозги можно хранить в запечатанных трубках и хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Для секции встраиваем образец ткани в оптимальную температуру резки, встраивая среду, и монтировать образец на диске образца. Затем приобрети серийные участки толщиной 30 микрометров в корональной плоскости в криотоме, переведя каждый участок в отдельные скважины 24-колодец культуры пластины, содержащей криопротекторный раствор в рамках подготовки к хранению минус 20 градусов по Цельсию.
Чтобы определить первые и последние участки каждого мозга, сравните морфологические особенности со стандартным атласом мозга мыши. НБМ начинается с брегмы минус 0,0 миллиметра и заканчивается при минус 1,6 миллиметра. Выбор каждого восьмого раздела дает в общей сложности шесть-семь секций и позволяет соответствующий коэффициент погрешности как для объема, так и для оценки длины волокна.
Для иммуногистохимической маркировки секций тканей, после блокирования любого неспецифического связывания с 10%нормальной сывороткой крупного рогатого скота в 0.1%Triton X-100 в Tris-буферном солевом растворе, маркировать секции с первичным антителом интереса в течение 48 часов при четырех градусах Цельсия. В конце инкубации, мыть разделы три раза в течение трех минут в свежем Tris-буферизированный солевой раствор на стирку, а затем инкубации с соответствующим биотинилированных вторичных антител в течение одного часа при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть разделы три раза в свежем Tris-буферный солевой раствор, как попродемонстрировано, а затем окрашивание с Avidin биотин пероксидазы комплекса и DAB peroxidase субстрат решение в соответствии с протоколами производителя.
После мытья, смонтировать все разделы из одного образца ткани мозга на один желатиновый слайд и позволить образцам высохнуть. Чтобы обезвоживать секции, погрузите образцы два раза в течение пяти минут на разбавление в последовательных восходящих растворов этанола, как указано, а затем очистка с двумя 10-минутными ксиленом моет. Затем используйте соответствующую среду крепления для установки крышки на слайды.
Для стереологии откройте новое исследование в программном обеспечении. Откроется окно диалога по инициализации исследования. Заполните информацию об исследовании и подтвердите, что выбирается многоуровневая дробная часть.
Дважды нажмите на громкость, чтобы открыть громкость диалоговой коробки. Назовите интересную функцию и выберите зонд подсчета ток региона и нажмите далее. Дважды нажмите на длину и уните название функции.
Выберите зонд сферы и нажмите дальше. В поле инициализации, чтобы кодировать группы перед началом исследования, установите общее количество разделов, начиная с первого раздела, содержащего область интереса, до последнего раздела, содержащего область интереса и интервал выборки раздела до восьми. Нажмите рядом, чтобы открыть диалоговую коробку инициализации зонда, которая автоматически установит наименьшее увеличение для выбора и оценки объема региона и подтвердит параметры.
Нажмите предварительный просмотр, чтобы проверить, можно ли определить область интереса при выбранном нижнем увеличении. Введите куб 50 000 микрометров на точку для фракции объема региона и нажмите предварительный просмотр и сделать. Под объектом высокого увеличения, установить длину до 63X и двойной щелчок длины, чтобы открыть длину сферы диалог поле.
Установите диаметр этой сферы до 10 микрометров и нажмите кнопку сделано. Установите соответствующие значения для области рамы, высоты рамы, зоны охраны и интервала между кадрами. Затем нажмите дальше и следуйте инструкциям, предоставленным программным обеспечением.
Чтобы вставить первый раздел, поместите слайд на сцену микроскопа под 5X цель и нажмите зеленую стрелку, чтобы нарисовать произвольные границы вокруг NBM для определения области интереса. Нажмите на зеленую стрелку и сделать, чтобы изменить цель 63X для получения измерения волокна текущей фракции. Появится диалоговая коробка толщиной раздела.
Установите верхнюю и нижнюю поверхность раздела для измерения фактической толщины раздела с помощью ручной ручки фокусировки z-оси и нажмите кнопку сделано. Медленно переместите z-ось сверху вниз в высоту рамы секции, чтобы отметить все пересекающиеся волокна на поверхности зонда виртуальной сферы. Когда все волокна были отмечены, нажмите рядом, чтобы перейти к следующему месту.
Когда все фракции будут завершены, нажмите зеленую стрелку. Программное обеспечение будет просить, чтобы следующий раздел вставляется. Принесите следующий образец на слайде в фокусе, используя цель 5X и повторите измерение волокна, как только что продемонстрировано.
Когда все разделы были измерены, программное обеспечение будет генерировать результат для случая, показывающего коэффициент значений ошибок. Если коэффициент погрешности приемлем, переходите к следующему делу. Если коэффициент ошибки неприемлем, программное обеспечение даст рекомендации по изменению некоторых параметров.
Когда все случаи будут завершены, создать результаты для каждого случая и группы. В этом репрезентативном эксперименте шведская группа белков-предшественников мутантов бета-амилоида продемонстрировала значительно более низкую длину волокна и плотность длины волокна по сравнению с их товарищами по помету дикого типа. Результаты также показали, что существенной разницы в объеме НБМ между двумя анализируемыми группами не было.
Этот метод требует надлежащего приобретения в правильной ориентации и хороший метод окрашивания с инкубационный период. Стереологический протокол может быть использован для оценки любых линейных профилей, таких как другие нейронные волокна, астроцитные процессы или даже сосудистые профили.
